庐山麻皮土豆种植于庐山植物园的试验田（LsM），海拔约1100米（中国庐山山上），或种植于庐山植物园鄱阳湖分园的试验田，位于庐山山脚。（LS），海拔约20米。中薯5号土豆（Zs）种植于与LS相同的试验田（即鄱阳湖分园试验田）。播种后约4个月收获土豆块茎，最初在4℃、黑暗、加湿培养箱（中国宁波科盛）中储存不超过7天（相对湿度：65%-70%），以最大限度减少采后的代谢波动。将块茎在流动自来水中充分冲洗4小时以上，以去除表面土壤。对于土豆块茎的内源微生物组分析，需进行额外处理：首先将块茎在75%乙醇中浸泡2分钟，快速灭活表面微生物；随后在2%次氯酸钠溶液中浸泡10分钟进行表面灭菌，接着用无菌超纯水连续冲洗5次以上，以去除残留消毒剂，确保彻底清除表面微生物污染。所有样品均在干冰条件下运输，用于营养成分分析、非靶向代谢物分析和内生微生物群落检测。整个过程中保持每个土豆的表皮完整。将每个清洗后的块茎切成约1立方厘米的小立方体，通过混合块茎外部、中部和内部区域的小块制备代表性的子样，以消除空间异质性。将混合后的子样立即用液氮研磨成细粉，用于后续分析。

庐山麻皮土豆是中国庐山的地方特产，以其独特风味闻名。中薯5号土豆（Zs）是中国从中薯3号选育出的高产、早熟、抗病且广泛种植的土豆品种，本研究将其作为参照土豆。庐山麻皮土豆（高海拔LsM、低海拔LS），又称庐山小土豆，块茎呈长椭圆形至细长形，具有独特的麻皮、乳白色果肉，尺寸小，直径约4厘米，长度约6厘米（图1中栏）。在低海拔地区种植时，庐山麻皮土豆块茎在形态和风味上会发生变化（图1右栏）。此外，从低海拔地区收获的块茎作为种薯在相同海拔重新种植时表现不佳，往往导致几乎完全减产。相反，中薯5号（Zs）块茎略扁圆，表皮光滑呈黄色，果肉呈浅黄色（图1左栏）。LsM和LS块茎比Zs块茎小得多（图1），因此单位产量较低。此外，庐山可用土地有限，导致LsM产量极低，价格高昂，甚至超过牛肉价格。

液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）广泛用于植物代谢组学分析。庐山麻皮土豆在庐山种植时以其优良风味而闻名。本研究采用基于LC-MS的非靶向代谢组学分析，以表征可能解释庐山麻皮土豆独特风味以及生长条件对土豆风味贡献的风味相关化合物。在正离子（POS）和负离子（NEG）模式下，分别检测到19652个和8509个有效峰。

主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结果显示，LsM、LS和Zs样品之间存在明显分离（图3A-D）。两个主成分（PC1和PC2）对LsM、LS和Zs之间代谢物浓度总差异的贡献率约为51%。在正离子模式下，PC1和PC2分别为29.9%和20.9%；在负离子模式下，PC1和PC2分别为29.2%和21.8%（图3A、B）。对于正离子和负离子模式，OPLS-DA模型成分1和2分别解释了LsM、LS和Zs之间总差异的51.7%（Q²=0.956，R²X=0.559，R²Y=0.993）和50.9%（Q^{2=0.946，R2X=0.562，R2Y=0.988）（图3C、D）。使用所有有效峰进行聚类分析，与PCA和OPLS-DA结果相似，在正离子和负离子模式下，样品均根据样品组聚为三组，即LsM、LS和Zs（图3E、F）。}

使用所有代谢物进行样品相关性分析，数据显示各组内所有样品的相关性较高，而LsM、LS和Zs之间的相关性较低，这证实了上述结果。此外，聚类热图（图3E、F）和火山图均显示，庐山麻皮土豆块茎样品（LsM/LS）中高含量的代谢物比Zs样品更丰富（正离子模式下，2296/3417种代谢物含量下调，6372/5357种代谢物含量上调；负离子模式下，917/1086种代谢物含量下调，2660/2769种代谢物含量上调）。

庐山麻皮土豆品种间存在显著的种内变异。具体而言，与LsM样品相比，LS样品在两种电离模式下表现出不同的代谢物谱：在负离子（NEG）模式下，1512种代谢物信号下调，1765种代谢物信号上调；在正离子（POS）模式下，信号较弱和较强的代谢物数量分别为4285种和2644种。

图3.庐山麻皮土豆块茎（LsM/LS）和中薯5号（Zs）块茎的不同代谢谱。（A，B）使用正离子（A）和负离子（B）模式数据进行主成分分析。（C，D）使用正离子（C）和负离子（D）模式数据进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。（E，F）正离子（E）和负离子（F）模式代谢物的热图分析。

将基于LC-MS的非靶向代谢组学数据中的有效峰与公共数据库（如人类代谢组数据库、Metlin、Massbank和mzCloud，访问日期均为2023年8月10日）进行比较，在正离子和负离子模式下分别鉴定出447种和147种代谢物。总共有334种正离子模式代谢物和127种负离子模式代谢物属于同一类别。丰度最高的类别包括羧酸及其衍生物、脂肪酰基、类固醇及其衍生物、有机氧化合物以及苯及其取代衍生物。其中，羧酸及其衍生物是最丰富的代谢物类别。

投影变量重要性值（VIP）是反映代谢物重要性的关键指标，用于评估样品之间的SDMs，其阈值设定为VIP>1。在POS模式下，LsM与Zs相比鉴定出205种SDMs（159种含量较高，46种含量较低）；在NEG模式下鉴定出58种SDMs（46种含量较高，12种含量较低），LsM与Zs之间共有263种SDMs（图4A、B）。LS与Zs相比，在POS模式下鉴定出189种SDMs（125种含量较高，64种含量较低）；在NEG模式下鉴定出51种SDMs（31种含量较高，20种含量较低），LS与Zs之间共有240种SDMs（图4A、B）。LS与LsM相比，在POS模式下鉴定出187种SDMs（80种含量较高，107种含量较低），在NEG模式下鉴定出50种SDMs（16种含量较高，34种含量较低），LS与LsM之间共有237种SDMs（图4A、B）。比较所有三组样品（LsM、LS和Zs），共鉴定出380种SDMs，其中POS模式下298种，NEG模式下82种。SDMs的相关性分析显示，SDMs之间具有高度相关性（图4A、B）。

为了预测对庐山麻皮土豆风味有贡献的关键代谢物，对LsM、LS和Zs之间的SDMs进行了机器学习分析。结果推测出可能在LsM、LS和Zs之间（Zs vs. LsM vs. LS）、LsM和Zs之间（Zs vs. LsM）以及庐山麻皮土豆内部（LsM vs. LS）不同风味中起重要作用的前20种代谢物（图4C-E）。庐山麻皮土豆（LsM和LS）中积累的代谢物比Zs中多，在Zs vs. LsM的比较显示出最显著的差异（图4D）。这种积累模式可能解释了庐山麻皮土豆和中薯5号土豆之间的风味差异，这些代谢物可能在塑造庐山麻皮土豆的风味方面发挥重要作用。庐山麻皮土豆LsM和LS内部也存在代谢物积累差异。这些机器学习结果预测了主要导致LsM和LS之间风味差异的代谢物（图4E）。

SDMs的KEGG富集分析表明，前20个富集途径主要与代谢相关（图4F-H）。这些数据可能表明，代谢过程是庐山麻皮土豆和中薯5号土豆之间代谢差异的主要原因（图4F-G）。此外，除代谢外，环境信息处理和遗传信息处理也可能在庐山麻皮土豆内部差异中发挥作用，从而导致其风味变化，尽管它们具有相同的遗传背景（图4H）。

综上所述，我们的结果表明，庐山麻皮土豆中含量升高的SDMs比含量降低的SDMs更多，这表明与中薯5号土豆相比，庐山麻皮土豆中含量升高的代谢物可能有助于其风味和口感。庐山麻皮土豆在不同海拔种植时，其口感和风味存在差异，这也反映在其代谢物的变化上。

图4.庐山麻皮土豆块茎（LsM/LS）和中薯5号（Zs）样品之间的显著差异代谢物（SDMs）。（A）热图显示LsM和Zs样品中显著差异代谢物的相对丰度。行代表单个显著差异代谢物，列代表样品（LsM1-LsM6、LS1-LS6、Zs1-Zs6）；颜色强度表示代谢物的归一化丰度（蓝色至红色表示丰度从低到高），反映了两个土豆品种之间显著差异代谢物的不同积累模式；（B）三个成对比较（Zs_vs._LsM、LsM_vs._LS、Zs_vs._LS）在正离子（上图）和负离子（下图）模式下显著差异代谢物的维恩图。该图量化了显著差异代谢物的重叠和独特性：重叠区域中的数字表示比较之间共有的显著差异代谢物，非重叠区域表示特定于单个比较的显著差异代谢物；（C-E）机器学习预测LsM、LS和Zs之间的关键显著差异代谢物。每个面板列出前20种代谢物，颜色强度表示相对丰度；（F-H）LsM vs. LS vs. Zs（F）、LsM vs. Zs（G）和LsM vs. LS（H）比较中显著差异代谢物的KEGG通路富集分析。x轴表示-log10（p值）（值越高，富集越显著）。

综上所述，庐山红皮土豆的独特风味由基因型驱动的风味相关营养物质/代谢物积累，与海拔诱导的内生微生物群变化共同决定。该研究为优化该品种品质、缓解低海拔种植风味劣变提供了理论支撑，助力其可持续产业发展。

ARF7和ARF19是侧根形成响应LP胁迫的关键调控因子。为阐明ARF7和ARF19在LP胁迫下调控主根生长的作用，分析了野生型（WT）、arf7、arf19及arf7 arf19突变体在LP胁迫下的主根生长。将这些植物的5日龄幼苗分别转移至1mmol/L（对照组）或1μmol/L Pi（LP）培养基中。在对照条件下，除arf7 arf19突变体中未形成侧根（Lateral Root，LR）外，所有基因型的主根长度和伸长率均未观察到显著差异（图1A-C）。然而，在低磷胁迫下，WT、arf7和arf19突变体均表现出主根生长受限（图1A）。值得注意的是，尽管存在LR形成缺陷，arf7 arf19突变体的主根长度仍显著长于其他植株（图1A、B）。此外，在LP胁迫下，arf7 arf19突变体的主根伸长速率显著高于其他植株（图1C）。这些结果表明，arf7 arf19突变体的主根生长对LP胁迫不敏感。为探究细胞对LP胁迫的响应，我们测量了PR分生组织区和伸长区的长度。在CK条件下，所有植物类型的PR尖端（包括分生组织区和伸长区）长度相似。然而，在LP胁迫下，arf7 arf19突变体的PR尖端长度显著长于其他类型。同样地，arf7 arf19突变体的分生组织区长度显著长于其他植株（图1D、E），PR伸长区亦呈现相同趋势（图1F）。在CK和LP条件下，过渡带皮层细胞的大小在所有植株类型中均相似（图1G、H），表明ARF7和ARF19的功能缺失突变不影响分生组织细胞的大小。在CK条件下，WT、arf7、arf19及arf7 arf19突变体的分生组织区皮层细胞数量分别为30.6、30.5、30.3和31.5，四种植株间无显著差异。然而在LP胁迫下，该数值分别为22.5、22.3、21.3和28.5。值得注意的是，arf7 arf19突变体的细胞计数显著高于其他植株。结果表明，在LP胁迫下，arf7 arf19突变体的PR尖端细胞分裂活动增强。

为研究PR尖端的细胞分裂情况，将arf7和arf19突变体与CYCB1;1:Gus标记系杂交。CYCB1;1基因作为增殖活性的指示标志，仅在G2/M期转换期间经历分裂的细胞中表达。在低磷胁迫下，与对照组（CK）幼苗相比，CYCB1;1:Gus幼苗的分生组织区Gus活性显著降低（图1I、J）。然而，尽管Pi缺陷型arf7 arf19 CYCB1;1:Gus幼苗的分生组织区Gus活性有所下降，但其活性仍显著高于Pi缺陷型CYCB1;1:Gus幼苗（图1I、J）。这些结果表明，在低磷胁迫下，arf7 arf19突变体的分生组织区细胞分裂活性仍高于野生型植株。

鉴于arf7 arf19突变体的PR生长对LP胁迫不敏感，这引发了关于ARF7和ARF19是否在LP胁迫下作为PR生长的负调控因子的问题。最初，我们观察到在LP胁迫下，野生型幼苗PR尖端的ARF7和ARF19表达量降低。为探究ARF7和ARF19在LP胁迫下对PR生长的作用，我们构建并验证了过表达ARF7和ARF19的转基因植株（35S:ARF7和35S:ARF19）。随后评估了这些转基因植株的PR生长情况。在对照条件下，35S:ARF7和35S:ARF19转基因植株的PR生长优于野生型植株。在LP胁迫下，35S:ARF7和35S:ARF19转基因植株的PR长度和伸长速率略高于野生型植株。结果表明ARF7和ARF19对PR生长具有正向调控作用，而观察到的arf7 arf19PR生长对LP胁迫的不敏感性并非ARF7和ARF19功能缺失突变的直接后果。

为评估升高的生长素是否导致LP-arf7 arf19突变体中PR生长抑制受损，我们用外源极性生长素转运抑制剂NPA处理了WT、arf7、arf19及arf7 arf19突变体。首先监测了DR5:Gus和arf7 arf19 DR5:Gus品系在NPA处理后PR尖端Gus活性的变化，发现5μmol/L NPA处理的LP胁迫植物中该活性进一步降低（图3A、B）。此外，与仅处于LP胁迫下的植株相比，在5μmol/L NPA处理的LP胁迫下，WT、arf7和arf19突变体的PR生长进一步受到抑制，表现为PR伸长速率以及分生组织和伸长区长度显著降低（图3C-F）。尽管LP胁迫对arf7 arf19突变体的PR生长影响不显著，但外源NPA处理显著抵消了这一优势（图3C-F）。这些结果表明，LP-arf7 arf19突变体中PR的旺盛生长依赖于其PR顶端丰富的生长素。

鉴于PR顶端生长素水平降低可能加剧LP胁迫下PR生长的抑制，我们研究了外源生长素对LP胁迫下PR生长的影响。将5天龄的野生型幼苗转移至添加不同浓度合成生长素1-萘乙酸（NAA）的LP培养基中（图3G）。当LP培养基中添加10⁻¹⁰mol/L NAA时，PR伸长率提高至对照组幼苗的41%，而未添加NAA的LP幼苗伸长率为26%（图3G，H）。添加10⁻⁹mol/L NAA时，伸长率达到对照组幼苗的58%（图3G，H）。然而，添加10⁻⁸mol/L NAA时，LP胁迫对PR生长的抑制作用加剧，仅显示对照组幼苗20%的伸长率（图3G，H）。因此，在LP胁迫下，10⁻⁹mol/L NAA是挽救磷缺乏植株PR生长的最有效剂量。在添加10⁻⁹mol/L NAA的LP胁迫下，DR5:Gus和CYCB1:1:Gus品系的PR尖端Gus活性显著增加，进一步证实生长素增加可促进PR尖端细胞分裂（图3I–L）。我们还评估了另一种合成生长素2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）的低剂量以及天然生长素IAA在LP胁迫下对PR生长的影响（图3M、N）。与10⁻⁹mol/L NAA的效果类似，当在LP培养基中补充10⁻⁹mol/L 2,4-D或10⁻⁹mol/L IAA时，PR伸长率增加了60%（图3M、N）。这些发现表明，生长素在调控磷缺乏植物的PR生长中起积极作用。

为验证生长素在低磷胁迫下对拟南芥PR生长的正向调控作用，我们以生长素过量突变体丝兰为研究对象（图3O）进行了分析。实验数据显示，在对照组和低磷条件下，丝兰幼苗的PR组织中IAA含量均显著高于野生型（图3P）。值得注意的是，对照组中突变体的PR生长与野生型无显著差异，但在低磷胁迫下，突变体的PR伸长速率明显快于野生型（图3O，Q）。这些数据有力证明了生长素在调控拟南芥低磷胁迫下PR生长中的关键作用。

图3.生长素对低磷胁迫下主根生长的影响。（A，B）DR5:Gus幼苗在1mmol/L Pi（对照组）、1mmol/L Pi加5μmol/L NPA（CK+NPA）、1μmol/L Pi（LP）以及1μmol/L Pi加5μmol/L NPA（LP+NPA）条件下PR尖端的Gus染色（A）和活性（B）。（C−F）野生型（WT）、arf7、arf19及arf7 arf19突变体在1μmol/L Pi（LP）和1μmol/L Pi加5μmol/L NPA（LP+NPA）条件下PR尖端（C）、PR伸长速率（D）、伸长区长度（E）和分生组织区长度（F）。（G，H）野生型幼苗在1mmol/L Pi（对照组）、1μmol/L Pi（LP组）、含10⁻¹⁰mol/L NAA的1μmol/L Pi（LP + 10⁻¹⁰M NAA组）、含10⁻⁹mol/L NAA的1μmol/L Pi（LP+10⁻⁹M NAA组）以及含10⁻⁸mol/L NAA的1μmol/L Pi（LP+10⁻⁸M NAA组）培养基中的PR生长（G）和伸长速率（H）。（I，J）DR5:Gus幼苗在1mmol/L Pi（对照组）、含10⁻⁹mol/L NAA的1mmol/L Pi（CK+10⁻⁹M NAA组）、1μmol/L Pi（LP组）以及含10⁻⁹mol/L NAA的1μmol/L Pi（LP+10⁻⁹M NAA组）培养基中PR尖端的Gus染色（I）和活性（J）。（K，L）CYCB1;1:Gus幼苗在1mmol/L Pi（对照组）、含10⁻⁹mol/L NAA的1mmol/L Pi（CK+10⁻⁹M NAA组）、1μmol/L Pi（LP组）以及含10⁻⁹mol/L NAA的1μmol/L Pi（LP+10⁻⁹M NAA组）培养基中PR尖端的Gus染色（K）和活性（L）。（M，N）1μmol/L Pi（LP）、1μmol/L Pi加10⁻⁹mol/L吲哚-3-乙酸（IAA）（LP+10⁻⁹M IAA）、1μmol/L Pi加10⁻⁹mol/L NAA（LP+10⁻⁹M NAA）以及1μmol/L Pi加10−9mol/L 2,4-D（LP+10⁻⁹M 2,4-D）培养基上的PR生长（M）和伸长率（N）。（O）野生型和丝兰幼苗在1mmol/L Pi（CK）和1μmol/L Pi（LP）培养基上的PR生长。（P）野生型和丝兰突变体在1mmol/L Pi（CK）和1μmol/L Pi（LP）培养基上PR尖端的IAA含量。（Q）野生型和丝兰突变体在1mmol/L Pi（CK）和1μmol/L Pi（LP）培养基上的PR伸长率。

在LP胁迫下观察到的PR活性降低可能与极性生长素运输有关。为研究极性生长素运输对LP胁迫下PR生长的影响，我们在二元培养基的上层或下层分别添加了外源生长素和生长素运输抑制剂（图4）。将5天龄的野生型幼苗转移至二元LP培养基中，仅允许PR顶端接触下层。当在下层补充10⁻⁹mol/L NAA（LP/LP+NAA）时，与二元LP（LP/LP）培养基上的幼苗相比，PR生长的抑制显著减轻，PR伸长明显增加（图4A、B）。相反，当在上部添加10⁻⁹mol/L NAA（LP+NAA/LP）时，LP胁迫诱导的抑制缓解效果仅是微弱的，且PR伸长量明显低于在二元LP培养基中添加NAA的下部（LP/LP+NAA）的幼苗（图4A、B）。当在下部添加10⁻⁶mol/L NPA（LP/LP+NPA）时，LP胁迫对PR生长的抑制加剧，导致PR伸长量相对于二元LP培养基（LP/LP）的幼苗显著减少（图4A、B）。然而，当在上部添加10⁻⁶mol/L NPA（LP+NPA/LP）时，LP胁迫诱导的PR生长抑制保持不变，且PR伸长量与二元LP培养基（LP/LP）的幼苗无差异（图4A、B）。这些结果表明，PR顶端内源生长素的运输在LP胁迫下对PR生长起着关键作用。

在拟南芥根中，极性生长素的运输依赖于PIN蛋白。具体而言，PIN1和PIN2对PR尖端的生长素梯度至关重要。由于LP胁迫抑制PR生长的原因在于PR尖端生长素运输的中断，LP胁迫可能影响PIN1和PIN2的活性。在PIN1p:Gus和PIN2p:Gus品系中，Gus活性检测显示，LP胁迫下PR尖端的PIN1和PIN2表达量显著降低，这一结果通过qRT-PCR分析得到进一步验证（图4D–F，J–L）。此外，在PIN1p:PIN1-GFP和PIN2p:PIN2-GFP转基因品系的PR尖端中，LP胁迫对PIN1和PIN2蛋白的影响同样显著（图4G、M）。在CK条件下，GFP荧光分析显示PIN1定位于PR茎细胞，而PIN2则存在于PR皮层和表皮细胞中（图4G、M）。在低磷胁迫下，虽然PIN1和PIN2在PR根细胞中的定位未发生改变，但PIN1p:PIN1-GFP和PIN2p:PIN2-GFP转基因株系的PR尖端GFP荧光相对值显著降低，表明低磷胁迫下PIN1和PIN2蛋白水平下降。为评估PIN1和PIN2在低磷胁迫下对PR生长的影响，检测了pin1和pin2突变体的PR生长情况（图4H、I、N、O）。与野生型幼苗相比，除异常存在三个子叶外，纯合pin1突变体还表现出对低磷胁迫的敏感性增强，表现为PR伸长速率降低（图4H、I）。同样，pin2突变体的PR生长对低磷胁迫敏感，其PR生长抑制程度高于野生型植株（图4N、O）。除PIN1和PIN2外，研究人员还在低磷胁迫下的PR中检测了另外两种生长素外排载体PIN4和PIN7。pin4突变体的PR生长对LP胁迫同样敏感，其伸长速率较野生型植株显著降低。相比之下，pin7突变体的PR生长与野生型植株高度相似，在LP胁迫下其伸长速率与野生型无显著差异。LP胁迫下，pin1、pin2、pin4和pin7的PR伸长速率分别仅为野生型的53%、69%、67%和91%（图4I、K）。这些结果表明，LP胁迫会抑制大多数PIN蛋白的活性。

PIN1和PIN2在根向地性中起关键作用，PIN2的功能缺失突变会导致根向地性丧失。鉴于LP胁迫会下调PR尖端的PIN1和PIN2活性，可以推断Pi缺乏植株的向性可能受LP胁迫影响。值得注意的是，当LP尖端幼苗在双层培养基上水平培养时，PR尖端暴露于LP而根上部暴露于CK培养基，它们表现出非向地性的PR生长（图4P）。相比之下，水平培养于双层培养基上的CK尖端幼苗（PR尖端暴露于CK，根部上段暴露于LP培养基）表现出典型的向地性PR生长（图4P）。此外，LP尖端茎的磷含量和鲜重显著高于CK尖端茎（图4Q、R）。这些观察结果间接支持了以下假说：在LP胁迫下，PIN蛋白在PR尖端的表达下调。

图4.在低磷胁迫下，依赖于PIN1和PIN2的极性生长素运输对主根尖的PR生长至关重要（A，B）。野生型（WT）幼苗在1μmol/L磷（LP）、含10⁻⁹mol/L NAA的1μmol/L磷（LP+NAA）以及含10⁻⁶mol/L NPA的1μmol/L磷（LP+NPA）二元培养基中的PR生长（A）和伸长速率（B）。（D，E）在1mmol/L磷（CK）和1μmol/L磷（LP）培养基中，PIN1p:Gus幼苗PR尖端的Gus染色（D）和活性（E）。（F）通过qRT-PCR分析，WT幼苗在1mmol/L磷（CK）和1μmol/L磷（LP）培养基中PR尖端的PIN1表达。（G）PIN1p:PIN1-GFP幼苗在1mmol/L Pi（对照组）和1μmol/L Pi（LP）培养基上PR尖端的GFP荧光。（H，I）野生型和pin1突变体在1mmol/L Pi（对照组）和1μmol/L Pi（LP）培养基上PR生长（H）和伸长速率（I）。（J，K）PIN2p:Gus幼苗在1mmol/L Pi（对照组）和1μmol/L Pi（LP）培养基上PR尖端的Gus染色（J）和活性（K）。（L）通过qRT-PCR分析，野生型幼苗在1mmol/L Pi（对照组）和1 μmol/L Pi（LP）培养基上PR尖端的PIN2表达。（M）PIN2p:PIN2-GFP幼苗在1mmol/L Pi（对照组）和1μmol/L Pi（LP）培养基下PR尖端的GFP荧光。（N，O）野生型和pin2突变体在1mmol/L Pi（CK）和1μmol/L Pi（LP）培养基上的PR生长（N）和伸长速率（O）。（P−R）野生型幼苗在1mmol/L Pi（CK）和1μmol/L Pi（LP）二元培养基上水平双向培养的PR向地性（P）、Pi含量（Q）和鲜重（R）。CK尖端，1mmol/L Pi培养基上的PR尖端和1μmol/L Pi培养基上的根上部；LP尖端，1μmol/L Pi培养基上的PR尖端和1mmol/L Pi培养基上的根上部。

鉴于下调的PINs在LP胁迫下有助于抑制PR生长，可以合理推测arf7 arf19突变体的PR顶端仍维持高水平的PINs。为验证这一假设，我们分别通过将PIN1p:PIN1-GFP和PIN2p:PIN2-GFP品系与arf7 arf19突变体杂交，获得了arf7 arf19 PIN1p:PIN1-GFP和arf7 arf19 PIN2p:PIN2-GFP品系。在对照（CK）条件下，arf7 arf19 PIN1p:PIN1- GFP和arf7 arf19 PIN2p:PIN2-GFP幼苗的PR顶端GFP荧光及其相对值分别略高于PIN1p:PIN1-GFP和PIN2p:PIN2-GFP幼苗（图5A、B、D、E）。在LP胁迫下，尽管所有幼苗类型的PR顶端GFP荧光及其相对值均有所下降，但与PIN1p:PIN1-GFP和PIN2p:PIN2-GFP幼苗相比，arf7 arf19 PIN1p:PIN1- GFP和arf7 arf19 PIN2p:PIN2- GFP幼苗的PR顶端荧光仍显著更高（图5A、B、D、E）。此外，在低磷胁迫下，与野生型植株相比，arf7 arf19突变体的PR区PIN1和PIN2表达水平显著升高（图5C、F）。这些结果表明，arf7 arf19突变体中PIN1介导的PR茎细胞生长素下游运输以及PIN2介导的PR皮层和表皮细胞生长素逆向运输均未受到低磷胁迫的干扰。为验证低磷胁迫下arf7 arf19突变体中极性生长素运输对PR区生长的重要性，我们通过将pin2、pin4和pin7突变体与arf7 arf19突变体杂交，构建了arf7 arf19 pin2、arf7 arf19 pin4和arf7 arf19 pin7三重突变体（图5G、H、S6）。由于纯合pin1突变体不育，我们无法获得arf7 arf19 pin1三重突变体。在CK条件下，野生型、pin2、pin4、pin7、arf7 arf19、arf7 arf19 pin2、arf7 arf19 pin4和arf7 arf19 pin7幼苗的PR生长均无显著差异（图5I-K）。值得注意的是，PIN2和PIN4的双功能缺失突变能够恢复arf7 arf19突变体在LP胁迫下的PR生长抑制。此外，在LP胁迫下，arf7 arf19 pin2和arf7 arf19 pin4三重突变体的PR伸长速率显著低于arf7 arf19突变体（图5G、H）。这些结果表明，LP-arf7 arf19突变体的旺盛PR生长源于PIN蛋白介导的生长素在其PR顶端的促进分布。进一步支持以下观点：在LP胁迫下，PR顶端生长素运输与分布受限是抑制PR生长的主要原因。

图5. arf7 arf19突变体在低磷胁迫下根系的旺盛主根生长依赖于PINs（A、B）。在1mmol/L磷（CK）和1μmol/L磷（LP）培养基中，PIN1p:PIN1-GFP和arf7 arf19 PIN1p:PIN1-GFP幼苗的PR尖端的GFP荧光（A）及其相对值（B）。（C、F）通过qRT-PCR分析，野生型（WT）和arf7 arf19突变体在1mmol/L磷（CK）和1μmol/L磷（LP）培养基中PR尖端的PIN1（C）和PIN2（F）表达。（D、E）在1mmol/L磷（CK）和1μmol/L磷（LP）培养基中，PIN2p:PIN2-GFP和arf7 arf19 PIN2p:PIN2-GFP幼苗的PR尖端的GFP荧光（D）及其相对值（E）。（G、H）在1mmol/L磷（CK）和1μmol/L磷（LP）培养基中，WT、pin2、arf7 arf19和arf7 arf19 pin2幼苗的PR生长（G）和伸长率（H）。

LP胁迫抑制PR生长的现象与分生组织和细胞伸长区中铁（Fe）的存在相关。然而，LP胁迫下Fe积累与生长素在PR顶端的运输和分布之间的关联仍不明确。组织化学染色和含量测定显示，LP胁迫下野生型PR的成熟区存在显著的Fe积累（图6A，B）。在缺乏LP胁迫的Fe²⁺（LP−Fe）条件下，PR顶端的铁积累减少，且PR生长对LP胁迫不敏感，其PR伸长速率与CK植株相当（图6A、B、H、I）。为研究铁积累对低磷胁迫下极性生长素运输的影响，我们在不同培养基上测量了PIN1p:PIN1-GFP和PIN2p:PIN2-GFP幼苗的PR尖端GFP荧光。在添加50μmol/L Fe²⁺的低磷条件下（LP+Fe），与单纯低磷胁迫相比，两种幼苗的PR尖端GFP荧光及其相对值均进一步降低（图6C、D、F）。而在低磷-铁条件下，其荧光显著恢复至与对照组植物相当的水平（图6C、D、F）。与此同时，PIN1、PIN2、PIN4和PIN7的表达量在LP胁迫下的PR处也与Fe水平呈负相关，表明积累的Fe抑制了PR顶端PINs的活性。在低磷（LP）+铁（Fe）条件下，DR5:GFP株系根尖的GFP荧光及其相对值均进一步下降（图6E，F）。相反，在LP-Fe条件下，这些值恢复到了与对照（CK）植株相当的水平（图6E，F）。同样，DR5:GUS株系的GUS活性在低磷（LP）-铁（Fe）条件下减弱，而在LP+Fe条件下增强（图6G）。我们的数据表明，在LP胁迫下，铁积累会负向调节PR尖端的极性生长素运输。鉴于arf7 arf19突变体的PR尖端极性生长素运输和分布未受影响（图2、5），可以合理推测arf7 arf19突变体PR尖端的Fe水平发生了改变。组织化学染色和含量测定显示，在LP胁迫下，arf7 arf19突变体PR尖端的Fe积累受到抑制（图6A、B）。此外，在LP+Fe条件下，arf7 arf19 DR5:Gus品系的PR尖端Gus活性较LP处理植株的活性显著降低（图6G）。与生长素活性一致，LP−Fe条件下PR生长的抑制作用减弱，而在LP+Fe条件下则增强（图6H、I）。LP+Fe条件下，arf7 arf19突变体的PR生长也较LP胁迫下的旺盛生长显著减弱（图6H、I）。这些结果表明，在LP胁迫下，铁积累负向调控PR尖端的生长素运输和活性，从而进一步限制PR生长。

图6.在低磷胁迫下，铁积累限制了极性生长素在主根尖端的运输和分布（A，B）。野生型（WT）和arf7 arf19突变体在1mmol/L Pi（对照组）、1mmol/L Pi加50μmol/L Fe（CK+Fe）、1mmol/L Pi无Fe（CK−Fe）、1μmol/L Pi（LP）、1μmol/L Pi加50μmol/L Fe（LP+Fe）以及1μmol/L Pi无Fe（LP−Fe）培养基中主根尖端的Perls Fe染色（A）和Fe含量（B）。（C−E）PIN1p:PIN1-GFP（C）、PIN2p:PIN2-GFP（D）和 DR5:GFP（E）种苗在1mmol/L Pi（CK）、1mmol/L Pi加50μmol/L Fe（CK+Fe）、1mmol/L Pi无Fe（CK−Fe）、1μmol/L Pi（LP）、1μmol/L Pi加50μmol/L Fe（LP + Fe）和1μmol/L Pi无Fe（LP−Fe）培养基中PR尖端的GFP荧光强度。（F）PIN1p:PIN1- GFP、PIN2p:PIN2- GFP和DR5:GFP种苗在1mmol/L Pi（CK）、1mmol/L Pi加50μmol/L Fe（CK+Fe）、1mmol/L Pi无Fe（CK−Fe）、1μmol/L Pi（LP）、1μmol/L Pi加50μmol/L Fe（LP+Fe）和1μmol/L Pi无Fe（LP−Fe）培养基中PR尖端的GFP荧光相对值。（G）DR5:Gus种苗在1mmol/L Pi（CK）、1mmol/L Pi加50μmol/L Fe（CK+Fe）、1mmol/L Pi无Fe（CK−Fe）、1μmol/L Pi（LP）。1μmol/L Pi添加50μmol/L Fe（LP+Fe）培养基，以及1μmol/L Pi无Fe培养基（LP−Fe）。（H，I）野生型（WT）与arf7 arf19突变体在1mmol/L Pi（对照组，CK）、1mmol/L Pi添加50 μmol/L Fe（CK+Fe）、1mmol/L Pi无Fe（CK-Fe）、1μmol/L Pi（LP）、1μmol/L Pi添加50μmol/L Fe（LP+Fe）及1μmol/L Pi无Fe（LP−Fe）培养基上的PR生长（H）与伸长率（I）。

铁积累会增强拟南芥根系活性氧（ROS）的生成，DAB染色分析显示，LP-WT和LP-arf7 arf19幼苗的PRs区域ROS活性显著升高，尤其在LP-WT植株的伸长区和成熟区（图7A）。在额外添加50μmol/L Fe的LP条件下，LP-WT和LP-arf7 arf19幼苗的PRs处ROS活性进一步增强。然而，在缺乏Fe的LP胁迫下，ROS活性减弱（图7A）。在LP胁迫下，Fe积累对PR尖端极性生长素运输和分布的影响可能归因于ROS活性。为验证这一假设，我们分别在CK和LP培养基中添加0.1mmol/L谷胱甘肽（GSH；一种已知的ROS清除剂）和1mmol/L过氧化氢，随后评估了PR尖端的极性生长素运输和分布（图7）。在LP+GSH条件下，野生型（WT）和arf7/arf19突变体的PR尖端活性均降低（图7A）。相应地，在LP+GSH条件下，PIN1p:PIN1-GFP和PIN2p:PIN2-GFP品系PR尖端的GFP荧光及其相对值显著升高，与对照（CK）植株相当（图7B、C、G）。同样地，DR5:GFP品系PR尖端的GFP荧光及其相对值也恢复至CK植株水平（图7D、G）。在LP+H₂O₂条件下，野生型和arf7 arf19突变体的PR尖端ROS活性显著增加。与此同时，PIN1p:PIN1-GFP和PIN2p:PIN2-GFP品系的PR尖端GFP荧光及其相对值出现明显下降（图7A）。一致地，在LP+H₂O₂条件下，DR5:GFP品系的PR尖端GFP荧光及其相对值也显著降低（图7D、G）。此外，野生型（WT）和arf7 arf19突变体在LP+GSH培养基上的PR生长表现出部分恢复，这与CK植株的表现相呼应，表现为PR伸长速率的增强（图7E、H）。然而，LP胁迫引起的PR生长抑制在外源过氧化氢处理下进一步加剧（图7F、I）。这些发现表明，在LP胁迫下，活性氧（ROS）的爆发对PR尖端的极性生长素运输和分布产生了负面影响。

利用两对近等基因系（NILs）CCRI12和CSSL1接种大丽轮枝菌（Verticillium dahliae），以评估色素腺体对黄萎病抗性的功能（图1a）。在接种的近等基因系的叶片和茎中测定了三个具有代表性的腺体形成基因CGF2、CGF3和GRAS1的转录水平，这三个基因分别控制腺体密度、全株腺体形成和茎腺体形成。在这两对品系中，与有腺体棉花（CCRI12/CSSL1-GL）相比，无腺体棉花（CCRI12/CSSL1-gl）叶片和茎中CGF2和CGF3的表达水平均显著下调（图1b、c）。然而，在相同的比较中，GRAS1的下调幅度低于CGF2和CGF3，且CCRI12-gl品系叶片中GRAS1的表达水平与CCRI12-GL品系相比无显著变化（图1d）。与腺体表型一致的是，接种V.dahliae后，有腺体品系CCRI12/CSSL1-GL的病害症状减轻，病情指数降低，棉酚含量增加，而无腺体品系CCRI12/CSSL1-gl则相反（图1e-g）。CCRI12/CSSL1-gl植株叶片和茎中五个棉酚生物合成基因CDNC、CYP706B1、DH1、CYP82D113和CYP71BE79的转录水平均显著低于CCRI12/CSSL1-GL植株，仅有个别例外。接种V.dahliae（1×10⁷ spores/mL）三天后，CCRI12近等基因系和CSSL1近等基因系中，有腺体植株根部这些棉酚生物合成基因的转录水平较无腺体植株显著上调（图1h）。

通过沉默GbCDNC和GbCYP706B1评估棉酚对棉花黄萎病抗性的影响。与空载体对照TRV:00植株相比，TRV:GbCDNC和TRV:GbCYP706B1植株中这些基因的表达水平显著下调。接种V.dahliae后，TRV:GbCDNC和TRV:GbCYP706B1棉花幼苗的病害症状更严重，病情指数更高，与相应的TRV:00植株相比。此外，TRV:GbCDNC和TRV:GbCYP706B1棉花幼苗根部的棉酚含量较TRV:00棉花幼苗显著降低。这些结果表明，有腺体棉花品系对V.dahliae感染的抗性高于无腺体品系，这可能是通过有腺体品系中CGF基因CGF2/3和GRAS1以及棉酚生物合成基因的高表达实现的。

通过在接种黄萎病菌（V.dahliae）21dpi（此时观察到最显著疾病症状差异）时，利用受感染的TRV:GbCGF2或TRV:GbCGF3与TRV:00棉花植株的根部进行两组RNA-seq实验，筛选出了GbCGF2和GbCGF3下游参与抗黄萎病菌的基因。TRV:00、TRV:GbCGF2和TRV:GbCGF3棉花植株根部的基因表达水平（RPKM值）和倍数变化。在TRV:GbCGF2与TRV:00对比组中，有2558个基因上调，3708个基因下调（图3a）；在TRV:GbCGF3与TRV:00对比组中，有2226个基因上调，3806个基因下调（图3b）。TRV:GbCGF2与TRV:00对比组和TRV:GbCGF3与TRV:00对比组之间共有1747个基因上调，2460个基因下调（图3c,d）。利用Metascape对这些共同的差异表达基因进行了功能基因本体（GO）富集分析。上调基因在“半胱氨酸和甲硫氨酸代谢”、“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解”、“光合作用”、“过氧化物酶体”和“脂肪酸降解”等条目中高度富集（图3e），而下调基因则在“苯丙烷生物合成”、“黄酮类生物合成”、“苯丙氨酸代谢”、“角质、木栓质和蜡质”以及其他植物代谢过程中高度富集（图3f）。角质、木栓质和蜡质生物合成途径已知与植物免疫有关。黄萎病菌是一种引起棉花黄萎病的真菌病原体，它通过穿透根部组织侵入棉花植株。因此，由角质、木栓质和蜡质生物合成途径形成的植物物理屏障可能在黄萎病的发病过程中发挥重要作用。因此，我们选择了与“角质、木栓质和蜡质”途径相关的基因进行详细研究。参与木栓质生物合成的几个基因，GbCYP86A1、GbFAR3、GbHHT1和GbPXG4，在GbCGF2和GbCGF3沉默的植株中的表达水平均低于对照植株（图3g）。RT-qPCR测定结果显示，与对照植株相比，GbCGF2和GbCGF3沉默的植株中GbFAR3的表达水平至少下调了5倍（图3h）。这些结果共同表明，色素腺相关过程通过调节角质、木栓质和蜡质生物合成途径来增强棉花对黄萎病的抗性。

图3.对沉默GbCGF2和GbCGF3的棉花根系进行转录组分析，以深入探究其对黄萎病菌（Verticillium dahliae）抗性的分子机制。（a,b）与对照（TRV:00）植株相比，沉默GbCGF2（a）和GbCGF3（b）的棉花植株中差异表达基因（DEGs）的数量。红色柱状图表示上调的DEGs，蓝色柱状图表示下调的DEGs。(c,d)各比较组间DEGs的维恩图。数字表示各组间共有和特有的DEGs数量。（e,f）利用KEGG通路分析，对维恩图中上调（e，1747个基因）和下调（f，2640个基因）的基因进行富集分析。x轴表示KEGG条目映射的总DEGs与所有基因的比例，颜色条表示基因的累积超几何P值，气泡表示KEGG条目中的基因数量。（g）从RNA-seq数据中获得的与角质、木栓质和蜡质生物合成相关基因的表达水平。颜色条表示（log₂（RPKM））表达水平的增加（红色）和减少（蓝色），|fold-change|>2。（h）通过逆转录-定量聚合酶链反应测定的GbCGF2和GbCGF3沉默棉花植株根部下调基因的相对表达水平。数据为三个生物重复的平均值±标准差（n=3；三个独立植株/生物重复）。星号表示通过Student's t-检验确定的统计学显著差异：*，P<0.05；**，P<0.01。

对GbFAR基因的系统发育分析显示，在G.barbadense中存在五个家族：GbFAR1、GbFAR2、GbFAR3、GbFAR5和GbFAR10，且每个家族中同源基因的拷贝数差异显著：GbFAR5和GbFAR10各含一个拷贝，GbFAR1和GbFAR2各含两个拷贝，而GbFAR3则含有四个拷贝。GbFAR3的四个同源基因（GbFAR3.1-A、GbFAR3.1-D、GbFAR3.2-A和GbFAR3.2-D）的序列及保守基序高度相似。对这些GbFAR同源基因的结构（外显子/内含子）分析显示，A基因组和D基因组同源基因的外显子分布极为相似，表明这些GbFAR基因具有平行功能。对黄萎病菌处理后这些木栓质生物合成基因转录水平的时间进程分析显示，GbFAR3.1和GbFAR3.2的表达在多个时间点显著上调，而GbFAR1、GbFAR2和GbFAR5的表达在此期间无显著变化（图4a）。值得注意的是，GbFAR3.1的表达模式与GbCGF2和GbCGF3高度相似（图2a），均从接种后6小时开始上升，24天时达到峰值（增加8倍），随后逐渐下降（图4a）。单独沉默GbFAR1、GbFAR2、GbFAR3.1、GbFAR3.2或GbFAR5后，接种黄萎病菌的棉花植株中，仅在TRV:GbFAR3.1、TRV:GbFAR3.2和TRV:GbFAR5植株中观察到病情加重、病情指数升高、维管束棕色染色加深以及感染茎部黄萎病菌生长增多，而TRV:GbFAR1和TRV:GbFAR2植株与对照植株相比无显著差异。TRV:GbFAR3.1植株的病情症状和病情指数均高于TRV:GbFAR3.2棉花植株。进一步地，我们单独下调和敲除了GbFAR3.1以探究其在黄萎病菌感染过程中的功能。与TRV:00植株相比，GbFAR3.1沉默植株中GbFAR3.1的表达降低，显著降低了对黄萎病菌的抗性，病情指数更高（图4b-e）。与TRV:00植株相比，TRV:GbFAR3.1植株的茎部棕色条纹更多，茎部黄萎病菌生长更多，维管组织中的真菌生物量增加了约2倍（图4f，g）。与对应的野生型（WT）植株相比，再生转基因GhFAR3.1-Cas9突变体植株的T1代也表现出降低的黄萎病抗性，病情指数更高。

利用标记了绿色荧光蛋白（GFP）的黄萎病菌进行感染实验，以可视化棉花根系的感染过程。与TRV:00植株相比，TRV:GbFAR3.1植株中观察到的绿色荧光强度更高，黄萎病菌孢子数量更多，且接种黄萎病菌后3、5和7天时，TRV:GbFAR3.1植株根系中的相对真菌生物量积累也更多。

通过浸润携带GFP标记的GbFAR3.1表达载体的烟草叶片，确定了GbFAR3.1的亚细胞定位（图4h）。检测到GbFAR3.1蛋白位于内质网（ER）中（图4i），这与它在木栓质生物合成途径中的功能一致。与TRV:00植株相比，TRV:GbFAR3.1植株中木栓质组成单体脂肪酸C16-C24的含量显著降低（图4j）。在GbFAR3.2沉默植株中也观察到类似结果，C18-C24脂肪酸含量降低，表明这两个同源基因具有平行功能。与TRV:00植株相比，TRV:GbFAR3.1植株根系中木栓质生物合成基因GbLACS1、GbKCS1/2、GbGAPT5和GbCYP86A1（但不包括GbCYP86A2）的转录水平显著降低。与GbFAR3.1沉默植株中角质、木栓质和蜡质形成所需的长链脂肪醇生物合成受到抑制相一致，这些植株的根细胞壁变得非常薄，且片层结构消失（图4k）。总体而言，这些结果表明，GbFAR3.1参与棉花根系细胞壁中木栓质的生物合成，并通过在根细胞壁中形成木栓质保护层来提高棉花对黄萎病菌的抗性。

图4.下调脂肪酸酰基辅酶A还原酶3.1（GbFAR3.1）降低棉花对黄萎病菌（Verticillium dahliae）的抗性。（a）感染黄萎病菌（V.dahliae）的海岛棉品种Hai7124中GbFAR3.1的表达模式。（b）接种TRV:GbCLA载体14天后棉花植株的白化表型。（c）接种黄萎病菌（V.dahliae）21天后TRV:00和TRV:GbFAR3.1幼苗的病情症状。（d）GbFAR3.1沉默（TRV:GbFAR3.1）棉花植株中GbFAR3.1的表达。（e-g）中所示TRV:00和TRV:GbFAR3.1棉花植株的病情指数（e）、茎部真菌生物量（f）、茎部维管束染色及PDA平板上茎部真菌生长情况（g）。（h）GbFAR3.1-GFP报告基因模型示意图。（i）本氏烟草叶片中GbFAR3.1-GFP的亚细胞定位。Mcherry代表带有HDEL:DsRed（红色）载体的内质网（ER）标记。（j）TRV:00和TRV:GbFAR3.1幼苗根系中木栓质单体脂肪酸组成。（k）使用透射电子显微镜观察TRV:GbFAR3.1和TRV:00棉花植株的根细胞壁。数据为三次生物学重复的平均值±标准差（n=3；三次独立植株/生物学重复）。星号表示通过Student’s t检验确定的显著差异：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。dpi，接种后天数。

转录组学分析以及GbCGF2（NAC）和GbCGF3（bHLH）的转录因子特性，我们推测这两个基因是否能够直接激活GbFAR3.1的转录。通过使用融合了绿色荧光蛋白（GFP）的GbCGF2和GbCGF3表达载体，在烟草（N.benthamiana）叶片中进行瞬时表达实验的亚细胞定位分析显示，绿色荧光信号与用DAPI染色的细胞核共定位，这表明GbCGF2和GbCGF3被定位到细胞核中，可能进行转录活动。在酵母中，使用将GbCGF2或GbCGF3的编码序列（CDS）融合到GAL4 DNA结合域的载体进行的转录激活实验显示，只有GbCGF2能够转录激活报告基因GAL4，而GbCGF3则不能，这表明GbCGF2具有转录激活功能，而GbCGF3在该实验中没有表现出此功能。

对GbFAR3.1、GbCGF2和GbCGF3基因上游2-kb启动子区域中存在的顺式作用调控元件的分析揭示了许多E-box（CANNTG）顺式元件的存在，这些元件是bHLH和NAC识别位点，表明它们的表达可能受到bHLH家族转录因子的调控。为了测试GbCGF2和GbCGF3是否能够结合到GbFAR3.1基因的启动子区域，我们进行了酵母单杂交（Y1H）实验。pAbAi-proGbFAR3.1的自激活实验显示，仅含有报告构建体的Y1H Gold报告菌株在SD/-Ura + 700 ng/ml AbA培养基上生长受到抑制。随后，将pAbAi-proGbFAR3.1酵母报告菌株用pGADT7-GbCGF2或pGADT7-GbCGF3效应子质粒转化，结果得到的转化子能够在SD/-Ura+700ng/ml AbA培养基上生长，这表明GbCGF2或GbCGF3能够有效地结合到GbFAR3.1的启动子上（图5b）。进一步，我们使用由GbFAR3.1启动子驱动的LUC报告构建体（ProGbFAR3.1:LUC）进行了LUC成像分析，并通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）浸润法将该构建体与35S:GbCGF2或35S:GbCGF3效应子共浸润到烟草叶片中。与用ProGbFAR3.1:LUC和对照空载体（EV）共转化的叶片相比，用ProGbFAR3.1:LUC和35S:GbCGF2或35S:GbCGF3共转化的叶片中LUC荧光强度增加（图5c,d）。与对照EV相比，当由GbFAR3.1突变启动子驱动并与GbCGF2和GbCGF3共表达时，LUC基因的LUC荧光强度显著降低（图5e-g）。此外，通过电泳迁移率变动分析（EMSA）证明了GbCGF2或GbCGF3与GbFAR3.1启动子上预测的E-box结合位点的结合（图5h,i）。这些结果表明，GbCGF2和GbCGF3在棉花中作为GbFAR3.1表达的转录激活因子发挥作用。

图5. GbCGF2/3调控GbFAR3.1的表达。（a）pAbAi-proGbFAR3.1的自激活实验。仅含有pAbAi-proGbFAR3.1报告构建体的Y1HGold报告菌株在SD（合成缺失）/-Ura+700ng/ml AbA（金担子素A）培养基上生长受到抑制。（b）在酵母单杂交（Y1H）实验中，GbCGF2或GbCGF3与GbFAR3.1的启动子结合。用pGADT7-GbCGF2/-GbCGF3和pAbAi-proGbFAR3.1质粒转化的Y1H Gold报告菌株能够在SD/-Ura + 700 ng/ml AbA培养基上生长。（c,d）使用GbFAR3.1或GbFAR3.1突变启动子与GbCGF2或GbCGF3相互作用的荧光素酶（LUC）成像分析。（e）示意图显示GbCGF2/GbCGF3在LUC和电泳迁移率变动分析（EMSA）中与GbFAR3.1启动子的E-box基序结合。野生型基序（5’-CACGTG-3’）和突变序列（5’-AAAAAA-3’）以品红色字体显示。（f,g）LUC活性显示为荧光强度的倍数变化。LUC信号在浸润后2天收集，误差条表示每次三个重复结果（每次三片叶子）的平均值±标准差（n≥3，P<0.05；**，P<0.001，t检验）。（h,i）在EMSA实验中，GbCGF2/GbCGF3直接与GbFAR3.1启动子的E-box基序结合。生物素标记的野生型（WT）探针和突变探针单独或与纯化的重组GbCGF2-His和GbCGF3-His一起孵育。加入竞争探针（109、509和1009）以确定结合的特异性。

在有腺体的陆地棉品系“jin668”中，通过CRISPR/Cas9技术敲除了GhCGF2或GhCGF3。为确保基因突变的效率，设计了两个sgRNA，每个sgRNA分别针对GhCGF2和GhCGF3的CDS区域，构建于sgRNA-Cas9表达盒中（图6a）。成功再生的T0代转基因GhCGF2-Cas9-19和GhCGF3-Cas9-5突变体植株分别表现出腺体密度降低和全株腺体缺失的表型（图6b）。从GhCGF2-Cas9-19和GhCGF3-Cas9-5植株的基因组DNA中扩增出Cas9基因（扩增片段为827bp），证实了突变体中存在Cas9-sgRNA表达盒（图6c）。同时，扩增出含有GbU6-7启动子和sgRNA1/sgRNA2-GhCGF2或sgRNA1/sgRNA2-GhCGF3两个靶点（扩增片段为500bp）的载体骨架，也证明了基因编辑表达盒在转基因植株中正常工作所需的引导RNA的存在（图6c）。对扩增片段的测序进一步显示，GhCGF2-Cas9-19和GhCGF3-Cas9-5转基因幼苗的突变类型主要包括两个靶点之间的碱基缺失和插入（图6d）。

我们进行了V.dahliae侵染实验，以评估GhCGF2-Cas9-19和GhCGF3-Cas9-5 T1代突变体植株对黄萎病的抗性。与野生型（WT）植株相比，突变体植株在感染后表现出更严重的病害症状、更强的茎部维管褐变程度以及更大的茎部真菌生长量，当感染茎段置于PDA培养基上培养时，这表明突变体对V.dahliae感染的抗性显著降低（图6e）。此外，与WT植株相比，GhCGF2-Cas9-19和GhCGF3-Cas9-5突变体植株的病情指数值分别增加了约20%和30%（图6f）。透射电子显微镜观察显示，GhCGF2-Cas9-19和GhCGF3-Cas9-5突变体植株的根细胞壁厚度显著降低，且片层结构消失，表明木栓质的沉积受到抑制（图6g）。与WT植株相比，GhCGF2-Cas9-19和GhCGF3-Cas9-5突变体植株中GhFAR3.1的转录水平分别降低了2倍和3倍（图6h）。与WT植株相比，GhCGF2-Cas9-19和GhCGF3-Cas9-5突变体棉花植株中其他几个木栓质生物合成基因如GhKCS1/2、GhLACS1和GhCYP86A1的表达也下调，但GhCGF2-Cas9-19植株中的GhCYP86A2除外（图6h）。此外，GhCGF2-Cas9-19和GhCGF3-Cas9-5突变体植株中木栓质组成单体脂肪酸C18-C22的含量也显著低于WT植株。与WT植株相比，GhCGF2-Cas9-19和GhCGF3-Cas9-5棉花植株中棉酚生物合成基因CDNC、CYP706B1、DH1、CYP82D113和CYP71BE79的转录水平也显著下调。

图6. CRISPR/Cas9介导的GhCGF2和GhCGF3转基因棉花植株基因编辑突变体的黄萎病抗性降低。（a）含sgRNA1/2-GhCGF2和sgRNA1/2-GhCGF3靶位点的转化载体示意图。sgRNA被设计为靶向GhCGF2或GhCGF3的A和D同源基因。（b）代表性GhCGF2-Cas9-19和GhCGF3-Cas9-5转基因T0代棉花植株叶片、叶柄和茎的腺体特征。（c）通过PCR扩增从含有Cas9和sgRNA1/2-GhCGF2或sgRNA1/2-GhCGF3表达盒的转基因棉花植株中提取的基因组DNA样品，检测Cas9基因及sgRNA-GhCGF2和sgRNA-GhCGF3靶向突变。（d）对本研究中使用的野生型（WT）、GhCGF2-Cas9-19和GhCGF3-Cas9-5植株的含靶位点基因组区域进行PCR产物测序。靶序列用品红色下划线标出。GhCGF2-Cas9-19和GhCGF3-Cas9-5植株的突变类型及突变比例显示在左侧，突变类型显示在右侧，缺失用“-”表示，插入用“+”表示，缺失或插入的碱基数用数字表示。A/D，A或D亚基因组。SNP，单核苷酸多态性。（e）用V.dahliae接种21天后，GhCGF2-Cas9-19和GhCGF3-Cas9-5转基因棉花植株（T1）的病害症状、茎部维管褐变及在PDA培养基上的茎部真菌生长情况。（f）中棉花植株的病情指数。（g）GhCGF2-Cas9-19和GhCGF3-Cas9-5转基因棉花植株根组织细胞壁的透射电镜照片。（h）GhCGF2-Cas9-19和GhCGF3-Cas9-5转基因棉花植株根部木栓质生物合成基因的相对转录水平。数据为三次生物学重复的平均值±标准差（n=3；三次独立植株/生物学重复）。星号表示经Student's t检验确定的统计学显著差异：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。dpi，接种后天数。

先前研究表明，CGF3的表达受茉莉酸（JA）处理诱导，对GbCGF2/3和GbFAR3.1启动子的分析表明，其表达可能也通过启动子区域中茉莉酸响应调控元件CGTCA框受JA调控。用3μM甲基茉莉酸（MeJA）处理抗病品种Hai7124，在处理后6、8、10和12小时，GbCGF2/3和GbFAR3.1的转录水平均提高了约2-4倍。用MeJA处理棉花植株根部后，棉酚生物合成基因CDNC、CYP706B1、DH1、CYP82D113和CYP71BE79的表达也呈现上调趋势，其中CDNC和CYP706B1上调最为显著，分别提高了约8倍和4倍。

为进一步了解GbCGF2/3和GbFAR3.1在JA介导的棉花抗黄萎病菌过程中可能发挥的作用，我们检测了TRV:GbCGF2/3和TRV:GbFAR3.1棉花植株中JA信号通路基因GbLOX、GbJAZ1、GbPDF1.2和GbPR4的转录水平。与TRV:00植株相比，TRV:GbCGF2/3和TRV:GbFAR3.1植株棉花根部GbLOX、GbPDF1.2和GbPR4的转录水平显著降低，而JA信号通路抑制因子GbJAZ1的转录水平则显著升高。与野生型（WT）植株相比，GhCGF2/3-Cas9敲除棉花植株中这些基因的转录水平也呈现出类似结果。这些结果表明，棉酚生物合成和JA介导的防御相关基因可能通过GhCGF2/3的调控参与棉花对黄萎病的抗性。

图7.腺体形成基因GbCGF2和GbCGF3通过促进棉酚及角质/木栓质合成以增强棉花对大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）抗性的作用机制假说模型。大丽轮枝菌侵染可诱导GbCGF2和GbCGF3的表达，二者结合至木栓质生物合成基因GbFAR3.1的启动子区域并激活其转录，进而促进木栓质生物合成并加固根细胞壁，最终提升对大丽轮枝菌的抗性。此外，植物激素茉莉酸（JA）可增强GbCGF2和GbCGF3的表达，诱导棉花根部棉酚防御途径并参与宿主对大丽轮枝菌的抗性。黑色箭头表示促进作用；虚线箭头表示不确定的促进作用。bHLH，碱性螺旋-环-螺旋；JA，茉莉酸。