建立中药指纹图谱，必须以化学成分研究和药理作用研究为基础，体现出系统性、特征性和稳定性三个基本原则。系统性指的是指纹图谱所反映的化学成分，其中应包括中药有效部位所含大部分成分的种类，或指标成分的全部。特征性是指中药指纹图谱所反映的化学成分信息（如保留时间或位移值）应具有较强的选择性，这些成分之间的顺序、比值在一定范围内是固定的，并且随药材品种不同而不同，通过这些信息综合分析结果，能够特征地区分中药的真伪与优劣，使其能够成为中药自身的“化学条码”。稳定性是指所建立的指纹图谱在规定的方法与条件下，应有很好的重现性，不同操作者、不同实验室应能做出相同的指纹图谱。重复做出的指纹图谱应在所允许的误差范围之内，这样才能保证指纹图谱的通用性和实用性。

本实验室基于液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）和质谱联用技术平台，可提供中药指纹图谱的方法建立与分析。

中药材、中药制剂原料药（包括饮片、配方颗粒）、中间体（生产过程中间产物）和中药制剂等。

样本准备：>10g，固体（干样）样本常温运输，固体样本（鲜样）和液体样本干冰运输。

由于中药来源广泛，所含化学成分的种类及数量繁多，同时受生长环境、采收时间、炮制方法等影响较大。所有样品的收集必须具有代表性，因此，需要收集来自不同产地、不同批号的样品15批以上，每批样品中取样量不少于3次试验量。同时做好详细记录。

注意事项：送样需尽可能详尽地了解药材、中间体及成品中所含成分的种类及其理化性质，经综合分析后找出成品中的药效成分或有效成分，作为成品及中间体指纹图谱的研究对象，即分析检测目标。

（1）前处理方法的开发：根据特征化合物的性质，选择合适的提取溶剂、萃取溶剂和提取方法，其中提取溶剂包括各种常用有机溶剂，提取方法包括但不限于浸提、超声提取、回流等；萃取步骤则为了净化待测溶液避免杂峰干扰。

图1.色谱峰图例

（2）液相方法开发：客户指定特征化合物，根据特征化合物建立指纹图谱的液相分析方法，包括流动相、色谱柱、柱温、洗脱梯度、洗脱时间、紫外吸收波长等液相条件。

（3）方法学考察：针对样品组分的专属性、精密度、稳定性、重复性、加标回收率、检出限、定量限等进行考察，客户可根据样品属性选择所需考核的内容。

        精密度：在规定条件下，独立测试结果间的一致程度。即取被测样品的供试品溶液，色谱条件下连续进样6次，记录色谱图，并计算保留时间的相对标准偏差（RSD），峰面积的RSD，确认测试仪器精度是否良好。

        稳定性：在相同的实验条件下，通过重复实验所得到的结果的一致性。即样品的供试品溶液在色谱条件下于不同时间进样分析，计算保留时间的RSD和峰面积的RSD，确保供试品溶液在相对时间内的稳定性。

        重复性：在同一实验室，由同一操作员使用相同的设备，按相同的测试方法，在短时间内对同一被测对象相互独立进行的测试。即制备样品的平行供试品溶液6份，色谱条件下测试计算含量，并计算峰面积和保留时间的RSD，表明方法的重复性良好。   

        加标回收率：检测开始前向样品中加入一定量的目标分析物，或使用有证标准物质（certified reference material，CRM），通过特定的程序检测所获得样品的目标组分含量或浓度，与加入样品中或存在于样品中的目标分析物含量或浓度的百分比。即精密称样后，根据样品中各组分按量精密加入对照品溶液制备相应的供试溶液，色谱条件下测定，计算加标回收率和RSD，表明实验结果准确。

        检出限：某特定分析方法在给定的置信度内可从样品中检出待测物质的最小浓度或最小值，又称检测限或测定下限。定量限：是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。定量限其本身体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力，特别是在杂质定量试验中，需要考察方法的定量限，以保证含量很少的杂质能够被准确测出。

（4）指纹图谱的建立及相似度评价：客户需提供不同产地，不同生产时间的药材或成方药，采集指纹图谱，采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”对色谱图进行匹配。

图2.指纹图谱相似度图例

（5）含量测试：基于已开发的方法学，根据标准曲线，计算特征化合物的含量。

图3.含量检测图例

1.高效液相色谱（HPLC）指纹图谱评价余甘子的质量

期刊名称：Journal of Ethnopharmacology          

影响因子：4.8                      

DOI号：https://doi.org/10.1016/j.jep.2020.112740

（1）研究内容

在本研究中，我们评估了来自中国广东、福建、云南和广西等10个不同产地的余甘果的HPLC指纹图谱和生物活性。同时，我们还测定了余甘果中三种单酚的含量，以评估指纹图谱的质量和一致性。另外，我们评价了10种余甘果的乙醇提取物（PEEE），发现它们具有抗氧化和抗炎活性，可增加T-SOD活性和GSH含量，减少MDA含量，抑制NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的产生。尤其是来自云南产余甘果的PEEE表现出最佳的抗氧化和抗炎活性。总之，余甘果的HPLC指纹图谱可以帮助改善其质量控制，余甘果还具有抗氧化和抗炎活性，可能在功能食品或药物开发中有潜在应用价值。

图1.10种不同产地余甘果的HPLC指纹图谱(A)和参考指纹图谱(B)。注：S1S10分别代表10个样品的色谱指纹图谱(YF GD、PN GD、ST GD、QZ FJ、ZZ FJ、CX YN、DL YN、BS YN、NN GX、WZ GX)， R为对应的平均图谱。序号1-14表示10个样品的特征峰。

（2）研究意义

利用高效液相色谱指纹图谱可以有效地控制余甘子（Phyllanthus emblica L.）的质量，并且表明具有抗氧化和抗炎活性的余甘子在功能性食品或药物开发的辅助治疗中具有潜在的应用前景。

2.HPLC指纹图谱对7个品种花椒皮的质量进行评价

期刊名称：Journal of Food Science

影响因子：3.294

DOI号：https://doi.org/10.1111/1750-3841.15095

（1）研究内容

本研究旨在通过对七个品种花椒果皮中的酚类化合物、生物活性和HPLC指纹图谱进行综合评价，并利用化学计量学分析方法筛选出其中的关键化合物，从而建立一套综合评价体系。结果表明，S2（奉贤大红袍）花椒果皮中总酚和芦丁含量最高，抗氧化活性最强，其次是S6（汉城十三香）。通过PCA分析，确定了花椒果皮中的另一个质量评价指标——金丝桃苷。根据PCA分析结果，将七个品种花椒果皮分为四类，其中S2（奉贤大红袍）、S5（汉城香椒）和S6（汉城十三香）属于第一类，S3（汉城红花椒）和S4（汉城大花椒）属于第二类，S1（富谷晚熟花椒）属于第三类，S7（汉城花椒）属于第四类。这些结果将有助于建立一套全面、有效的花椒果皮质量评价体系，并为高品质花椒果皮的种植、花椒果皮食品、药品和保健品的开发提供理论依据。

图2.花椒皮的HPLC图谱及化合物结构。(A)：7个品种花椒皮的HPLC图谱。绿原酸(6.261 min，峰5)、表儿茶素(7.897 min，峰6)、芦丁(11.301 min，峰7)、金丝桃苷(12.823 min，峰8)、三叶草脂(14.737 min，峰9)、槲皮素(16.172 min，峰10)6个化合物的保留时间(min)。8个常见峰：峰1到5和峰8到10。(B)：黄杨果皮中6种酚类化合物的结构。

（2）研究意义

通过酚类化合物、生物活性、HPLC指纹图谱结合化学计量学分析，对7个品种花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）皮的质量进行评价，并筛选出关键化学成分化合物。这些结果将有助于建立有效、全面的花椒皮评价体系。

参考文献：

1.刘丽芳主编. 中药分析学[M]. 2019

2.徐颖婕,王学芹,刘天蔚，帅莉. 中西医结合分子生物学[M]. 2023

3.解军波,张彦青,桑林涛主编. 中药材及饮片鉴定知识与方法[M]. 2015

4.贡济宇主编. 药物分析[M]. 2017

5.柳文媛主编,宋沁馨,吴春勇副主编. 药物分析进展.第2版[M]. 2018.

6.Yunjiao Chen,Yong Cao,et al."HPLC fingerprint analysis of Phyllanthus emblica ethanol extract and their antioxidant and anti-inflammatory properties". Journal of Ethnopharmacology.2020.

7.Dongmei Wang ,Dengwu Li,et al. "Quality evaluation of different varieties of Zanthoxylum bungeanum Maxim. peels based on phenolic profiles, bioactivity, and HPLC fingerprint".Journal of Food Science.2020.