其计算公式如下：

该方法是假设底物的代谢等于土壤有机质的代谢，但土壤有机质的代谢会低于底物的代谢，会存在高估CUE的情况，且结果易受底物类型的影响。

微生物碳利用效率（CUE）目前被广泛用于评估微生物代谢，是碳循环模型中的一个重要参数。微生物CUE指的是新形成的微生物生物量碳与微生物吸收的总碳量之比。最近，¹⁸O标记水方法被用于其估算，因为一项比较分析表明，与其他可用方法相比，该方法最可靠且变异最小。该方法的前提是微生物DNA合成中所用的氧完全来源于所施加的水（图1d）。然而，其他来源的氧也可能参与微生物DNA的合成，这可能使该前提不成立，并导致微生物CUE估算的不确定性。最近一项研究发现，在微生物DNA合成中，来源于水的氧与来源于葡萄糖的氧的比例为9:1。由于葡萄糖是土壤有机碳（SOC）中最不稳定的形式，该研究表明在CUE测量实验中，SOC中的氧原子对微生物DNA合成中氧的贡献应该非常低。然而，除了SOC和细胞外水，微生物也可能利用代谢水来合成DNA（图1b）。微生物细胞持续进行着各种代谢过程，某些代谢途径会产生新的水，称为代谢水。产生代谢水的一个重要过程是有氧呼吸，这是一种生物氧化作用。在此过程中，O₂在线粒体内膜上作为电子受体，与活化的氢结合，在细胞内形成代谢水（图1a）。先前研究发现，在微生物细胞活跃生长期间，代谢水可占细胞内水的70%，尽管这个比例在稳定期或静止期细胞中要低得多。迄今为止，代谢水是否可能参与微生物DNA合成中的氧供应仍不清楚。最近一项研究基于数学模型提出，假设DNA合成中的氧有30%来源于细胞外水以外的其他来源，那么¹⁸O-H₂O方法会低估CUE。在此，我们采用¹⁸O标记的O₂和¹⁸O标记的H₂O，在48小时培养期间测定它们对微生物DNA合成中氧的贡献，以评估¹⁸O标记水方法测量微生物CUE的准确性。

图1.微生物DNA合成中氧原子潜在来源的示意图解显示，细胞内结构经简化处理，仅呈现DNA与水分子。氧气参与的有氧呼吸作用（a）及其他代谢过程（f）产生代谢水，该代谢水可能被用于DNA合成（b）。代谢水亦可外排至细胞外（c），或与其他氧阴离子发生氧同位素交换（e）。若代谢水扩散至胞外，其同位素信号将被胞外水稀释；已有研究发现胞外水参与微生物DNA合成（d）。本研究旨在验证途径a→b的通量是否显著高于途径d。若存在显著通量，则当前基于¹⁸O标记胞外水的微生物碳利用效率测定方法需重新评估以提高准确性；若通量不显著，则表明途径c、e、f可能是尚未明确的重要代谢通量，需开展深入研究。

本研究采集中国长白山温带森林土壤样品（详见表S1）。样品经实验室过筛（<2mm）后，调节至最大持水量的50%，于15℃预培养7天。预培养结束后，称取64份1克土壤分样置于2毫升螺口瓶中（16种处理×4重复，见表S2）。将半数样品添加100μL ¹⁸O标记水（5、10、20、30、40、50、60原子百分比梯度），另半数添加等量非标记水。所有样品瓶置于1升广口瓶中，以40mL/min流速通入氮气40分钟（经预实验氧浓度检测验证可完全置换氧气）。随后向非标记水组注入210mL梯度¹⁸O标记氧气（5、10、20、30、40、50、60原子百分比），向¹⁸O标记水组注入等量非标记氧气，使瓶顶空气氧浓度达21%（v/v），并设置非标记水/氧对照组。根据前期优化的培养时间，样品于15℃培养48小时。培养结束后经冷冻干燥处理，采用MoBio PowerSoil DNA提取试剂盒获取DNA，最终通过高温裂解元素分析仪-同位素比值质谱联用系统（IRMS-TC/EA）测定总氧含量及¹⁸O丰度。

表S1.本研究采样点信息及土壤性质（0-5cm土层，均值±标准误，n=4）。

注：土壤碳氮比（Soil C/N ratio，即土壤有机碳与全氮量之比）、土壤氮磷比（Soil N/P ratio，即全氮量与全磷量之比）、微生物生物量碳—氮比（MBC/MBN，即微生物生物量碳与微生物生物量氮之比）以及微生物生物量氮—磷比（MBN/MBP，即微生物生物量氮与微生物生物量磷之比）是本研究的核心计量参数。

表S2.呈现了本研究的实验设计方案。

本研究采用以下方程定量解析培养期间微生物DNA合成过程中水分子与氧气对氧原子的相对贡献率：

基于标记实验获取的DNA¹⁸O原子超量值（y₁表示¹⁸O-H₂O处理组，y₂表示¹⁸O-O₂处理组）与环境基质¹⁸O丰度（x1：土壤水相，x₂：气相O₂），结合DNA合成速率b（ng DNA·g⁻¹干土·h⁻¹）及培养时间t（0–48h边界条件：t=0时，APE-¹⁸O_DNA=0；t=48时APE-¹⁸O_DNA=O_T×y）。其中总氧含量OT依据DNA分子式（C₃₉H₄₄O₂₄N₁₅P₄）理论氧质量分数31.2%计算；最终通过胞外水来源氧与O₂来源氧的比值1：a，因此，H₂O来源氧与O₂来源氧对新合成微生物DNA的相对贡献率分别计算为（1/（1+a））和（a/（1+a））。

微生物DNA的¹⁸O原子超量值（APE-¹⁸O）与添加水相及氧气的¹⁸O原子超量值呈显著正相关（表1，图S1），其回归斜率分别为0.0016（水相）和0.000012（氧气）。定量解析表明：新合成微生物DNA中99.25%的氧原子来源于胞外水，仅0.75%来源于氧气。本评估未考虑土壤有机碳来源氧的贡献，因既往研究证实SOC衍生氧对DNA合成的贡献率极低。基于氧气对微生物DNA合成的微弱贡献（<1%），¹⁸O标记水法评估受试森林土壤微生物碳利用效率具有可靠性。

表1.呈现了添加示踪剂后15℃培养48小时条件下，土壤微生物DNA中¹⁸O原子超量值（APE-¹⁸O，%）与土壤水相或气相氧气APE-¹⁸O的回归统计参数。

图S1.呈现了15℃培养48小时后，土壤微生物DNA中¹⁸O原子超量值（APE-¹⁸O，%）与土壤水相（a）或氧气（b）APE-¹⁸O的函数关系。数据点以均值±标准误表示。

本研究证实：培养期内氧气对微生物DNA氧原子的贡献率微乎其微，其根本机制在于代谢水在细胞内DNA合成水相中占比极低。尽管纯培养研究曾报道代谢水对微生物生长的显著氧贡献，但此类结论源于单菌株最优培养体系，与土壤整体培养环境存在本质差异。如体系复杂性差异：纯培养采用单一菌种最适条件，而土壤微生物群落具高度多样性且受营养盐-温度-水分等自然条件制约，其中休眠态微生物占主导（>80%活细胞），且不同类群代谢水利用模式存在显著分异；生长策略差异：纯培养菌株多为r-策略者（倍增时间<2h），而土壤微生物群落以k-策略者为主（倍增时间>50h），其代谢活性较实验室体系降低1-2数量级。基于细胞质水自由跨膜扩散的特性（图1c），同位素标记代谢水在土壤中发生快速外排效应。以球形红细菌（Rhodobacter sphaeroides）为例，其氧化酶催化反应产生的水分子约78%释放至周质空间并外排至胞外，与胞外水达成同位素平衡。因代谢水日产量（<0.5μmol·g⁻¹干土）不足胞外水总量（>500μmol·g⁻¹干土）的千分之一，一旦扩散至胞外，其同位素信号即被指数级稀释（稀释因子>10³），导致¹⁸O-O₂处理组DNA的¹⁸O原子超量值始终低于检测限（<0.005atom%）。

氧气在代谢水与其他氧含物（如CO₃²⁻、PO₄³⁻和NO₃⁻）之间的交换也可能稀释了代谢水的¹⁸O信号（图1e）。例如，尽管呼吸作用产生的CO₂中的氧来源于土壤有机碳（SOC），但其在碳酸酐酶的催化下会迅速与水中的氧发生交换。此外，水也被发现与亚硝酸盐发生氧原子交换，尽管其通量可能不高。或者，O₂可能对代谢水的贡献并不显著。细胞组分的分解和生物合成、外部营养物质的降解和转化也可能产生代谢水。然而，这些过程目前仍不完全清楚，未来的研究需要进一步阐明这些复杂的过程。尽管如此，我们的研究表明，在48小时的土壤培养后，O₂衍生的氧对新合成DNA的贡献低于1%，而¹⁸O标记水的方法对于评估所测试森林土壤的微生物碳利用效率（CUE）是可靠的。这一建议并不一定适用于其他类型的土壤，因为不同土壤的性质和微生物群落存在差异。未来的研究需要在其他类型的土壤中验证本研究的发现。