期刊名称：Plant Biotechnology Journal

影响因子：10.5

DOI：https://doi.org/10.1111/pbi.70356

1.研究内容

本研究以盐碱和低温复合胁迫下紫花苜蓿的适应性机制为核心，采用代谢组学与转录组学整合分析策略，系统解析了耐盐碱型苜蓿品种Zhao dong（ZD）和敏感型苜蓿品种Blue Moon（BM）的响应差异。研究首先通过田间表型观察发现，ZD在低温胁迫下通过强化根系生长（根长增加18.45%-68.50%）和积累渗透调节物质（可溶性总糖、脯氨酸）维持细胞活力，而BM的丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量显著升高，表现出膜脂过氧化损伤。进一步代谢组分析揭示，ZD在胁迫下特异性积累异黄酮、棉子糖等核心代谢物（log₂FC≥1.2），其中棉子糖作为渗透保护剂可降低细胞冰点，异黄酮则通过清除活性氧（ROS）缓解氧化胁迫。转录组数据表明，ZD中黄酮类合成通路（CHS、CHI基因）、淀粉降解通路（BAM1、AMY基因）及谷胱甘肽代谢通路（G6PDH、GR基因）显著上调，与代谢物积累趋势高度一致。通过WGCNA共表达网络分析，筛选出MsBAM1等10个核心调控基因，其功能涉及糖代谢调控（TPS1、GolS2）、ROS清除（G6PDH、GR）及逆境信号转导（MYB2、ABF2）。基因编辑实验证实，MsBAM1基因沉默导致β-淀粉酶活性下降62.3%，可溶性总糖含量减少41.7%，植株抗逆性显著降低，从而验证了碳水化合物代谢在盐碱和低温复合胁迫响应中的核心作用。本研究首次揭示了紫花苜蓿通过“黄酮类抗氧化-糖代谢渗透调节-GSH解毒”协同机制适应盐碱和低温胁迫的分子网络，为抗逆品种选育和盐碱地利用提供了理论依据。

图1.模型图展示了紫花苜蓿在应对盐碱与低温复合胁迫时的生理及分子机制：左上角（转录组）展示了通过WGCNA筛选出的10个核心基因；左下角（代谢组），彩色圆圈代表不同的代谢物类别，圆圈的大小表示代谢物含量的高低，越大则含量越高；右上角（形态学），箭头指示了显著增强的形态学参数，包括鲜重（FW）和干重（DW）；右下角（生理学），三角形代表生理指标，颜色深浅表示指标含量的高低，其中SS代表可溶性总糖，Pro代表脯氨酸，TFC代表总黄酮含量，MDA代表丙二醛。

2.研究结果

（1）紫花苜蓿耐盐碱和低温响应机制：表型与生理适应性的品种差异研究

通过田间试验结合生理生化分析，系统比较了ZD和BM在盐碱土低温胁迫下的响应差异。方法上，采用定期采样监测生长动态（2022年8-12月），测定表型指标（株高、根长、生物量）及生理指标（脯氨酸、可溶性总糖、总黄酮、H₂O₂、MDA、根系活力），并通过单因素方差分析评估显著性。结果显示，ZD虽地上部分生长受抑制，但通过显著增强根系补偿生长（根长增加18.45%-68.50%）和地下部分生物量积累（根鲜重/干重较BM高3.55倍），有效维持整体活力；同时，ZD通过高效积累渗透调节物质（可溶性总糖含量较BM高2.81倍）和抗氧化物质（总黄酮含量高1.19-1.49倍），显著降低膜脂过氧化水平（MDA含量较BM低68.50%），并保持较高的根系活力（12月较BM高3.55倍），从而形成“渗透调节-抗氧化-根系优化”的综合抗逆机制。相比之下，BM因抗氧化能力弱和根系功能衰退，表现出显著的胁迫敏感性。研究为盐碱地紫花苜蓿品种选育提供了表型与生理层面的关键依据。

图2.展示了在低温条件下，种植于盐碱土中的紫花苜蓿品种ZD和BM的田间表型、生物量及生理指标的变化：（a）2022年8月和10月ZD与BM在盐碱土中生长的田间表型对比；（b）植株高度；（c）根长；（d）地上部分鲜重；（e）根鲜重；（f）地上部分干重；（g）根干重；（h）脯氨酸含量；（i）总黄酮含量；（j）可溶性糖含量；（k）过氧化氢含量；（l）丙二醛含量；（m）根系活力。

（2）盐碱与低温胁迫下紫花苜蓿品种代谢响应差异

通过非靶向代谢组学技术结合多元统计分析，系统比较了ZD与BM在盐碱与低温复合胁迫下的代谢响应差异。研究采用LC-MS平台对根组织样本进行代谢物全谱检测，在10月（冷驯化期）和12月（冰冻期）共鉴定出4605个差异积累代谢物（DAMs），涵盖14大类物质；通过分析表明，ZD在12月显著富集的代谢物数量（703个）较BM（345个）多1倍，且以黄酮类、含氧化合物为主，而BM的脂肪酸类代谢物显著减少。进一步KEGG富集分析揭示，ZD的苯丙烷类、异黄酮及黄酮醇生物合成通路在胁迫期间持续激活，特异性积累异亮氨酸、富马酸、棉子糖等渗透调节物质和抗氧化成分，而BM的同类通路代谢物含量大幅下降；动态比较表明，ZD通过强化碳水化合物（如棉子糖、葡萄糖）降解供能和黄酮类物质清除ROS协同机制增强抗逆性，而BM因代谢调节能力不足导致膜脂过氧化加剧和根系功能衰退。该结果阐明了代谢物动态变化与品种抗逆性分化的直接关联，为盐碱地紫花苜蓿抗逆机制解析提供了代谢层面的关键证据。

图3.展示了在盐碱与低温复合胁迫下，ZD与BM两个紫花苜蓿品种间差异积累代谢物（DAMs）的数量及分类统计，连接带的颜色根据代谢物类型进行区分。

（3）ZD与BM品种差异及抗逆机制关联

通过Venn图分析与热图可视化，系统筛选了ZD与BM在盐碱和低温复合胁迫下的核心差异代谢物（Core DAMs），发现ZD在胁迫期间特异性积累89个核心代谢物，涵盖氨基酸、有机酸、碳水化合物、脂肪酸及黄酮类等五大类，其相对丰度显著高于BM，尤其在冰冻期黄酮类与含氧化合物积累量较BM多1倍以上，而BM的脂肪酸类代谢物显著减少；进一步分析表明，ZD通过棉子糖等渗透调节物质维持细胞水分平衡、异黄酮等抗氧化成分清除ROS、以及淀粉降解产物（葡萄糖）提供能量供应的协同机制增强抗逆性，而BM因代谢调节能力不足导致膜脂过氧化加剧（MDA含量较ZD高68.50%）和根系功能衰退，该结果揭示了核心代谢物动态积累模式与品种抗逆性分化的直接关联，为盐碱地紫花苜蓿抗逆品种选育提供了关键代谢标志物。

图4.在盐碱与低温复合胁迫下，ZD和BM两个紫花苜蓿品种的核心代谢物。通过韦恩图分析，鉴定了ZD在复合胁迫条件下（10月和12月）上调的差异代谢物；热图则展示了ZD和BM中核心代谢物的相对丰度。

（4）转录组多维度分析揭示紫花苜蓿抗逆品种对盐碱和低温复合胁迫的特异性响应机制

通过主成分分析、韦恩图分析及KEGG富集分析三种方法，系统解析了ZD在盐碱与低温复合胁迫下的转录调控机制。首先，PCA分析显示不同品种及采样时间的转录组数据存在显著分离，表明复合胁迫下基因表达模式具有品种特异性；其次，韦恩图筛选出ZD在10月（盐碱-冷驯化胁迫）和12月（盐碱-冻结胁迫）较9月对照特异上调的差异基因（分别达3717个和5630个），其表达水平显著高于敏感品种BM；最后，KEGG富集分析揭示这些核心基因高度富集于半乳糖代谢、淀粉与蔗糖代谢、黄酮类生物合成等通路，表明ZD通过激活碳水化合物合成（如棉子糖、海藻糖）和黄酮类物质积累（如异荭草苷）来增强抗逆性。研究结论证实，ZD的抗逆性源于其对复合胁迫的特异性转录重编程，尤其通过代谢通路协同调控实现渗透保护与抗氧化防御。

图5.转录组数据的整体分析：（a）主成分分析，其中x轴和y轴分别代表PC1和PC2的得分；（b）韦恩图分析，用于鉴定在10月和12月复合胁迫条件下相对于9月对照，ZD品种中特异上调的差异表达基因；（c）核心基因的KEGG富集分析。

（5）WGCNA分析揭示枢纽基因与核心代谢物的共表达网络及关键调控基因

这部分内容主要采用了加权基因共表达网络分析（WGCNA）的研究方法，通过构建基因共表达网络，识别出15个基因共表达模块；进一步分析了这些模块与核心代谢物含量之间的关系，发现MEturquoise模块与核心代谢物含量显著正相关；最终筛选出包括MsBAM1在内的10个枢纽基因，这些基因在应对盐碱和低温复合胁迫中起到关键调控作用，并通过构建基因共表达网络揭示了它们之间的相互作用关系。

图6.加权基因共表达网络分析（WGCNA）结果。（a）基因共表达网络软阈值的确定。（b）基因共表达模块的聚类树状图，其中主分支形成了15个用不同颜色标记的模块。（c）模块与核心代谢物含量之间的关系，其中每行和每列分别代表一个模块和一个代谢物。（d）在联合胁迫条件下核心基因的共表达网络。

（6）转录组与代谢组联合分析揭示ZD品种抗逆性增强的分子机制

采用转录组与代谢组联合分析的研究方法，通过对比ZD和BM在碳水化合物、谷胱甘肽、黄酮类及水杨酸代谢途径中的基因表达和代谢物含量差异，发现ZD在这些途径中表现出更高的基因表达活性和代谢物积累量，特别是在冷应激和盐碱胁迫下，ZD能显著上调与糖合成、谷胱甘肽合成及黄酮类合成相关的基因（如TPS、GALM、GolS2、GS、GR、CHS等），从而增强了其抗逆性。

图7. ZD与BM在碳水化合物、谷胱甘肽、黄酮类化合物及水杨酸相关代谢途径中基因表达与代谢物含量的差异。（a）碳水化合物相关途径。（b）谷胱甘肽代谢相关途径。（c）黄酮类化合物代谢相关途径。（d）SA生物合成与信号转导途径。在热图中，每一行代表一个基因或代谢物，而六列则分别代表来自不同月份的ZD与BM样本。红色和蓝色热图表示基因表达丰度，而橙色和绿色热图则代表代谢物的相对丰度。酶注释说明：GALM为半乳糖变旋酶；GolS2为肌醇半乳糖苷合成酶2；RFS为棉子糖合成酶；TPS为海藻糖-6-磷酸合成酶；AMY为α-淀粉酶；BAM为β-淀粉酶；GS为谷胱甘肽合成酶；GR为谷胱甘肽还原酶；G6PD为葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶；PGD为6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；GPX为谷胱甘肽过氧化物酶；CHS为查尔酮合成酶；CA4H为肉桂酸-4-羟化酶；CHR为查尔酮还原酶；CHI为查尔酮异构酶；PAL为苯丙氨酸解氨酶。

（7）MsBAM1-RNAi转基因苜蓿抗逆性评估：生理生化指标与光合性能分析

采用RNA干扰（RNAi）技术结合生理生化指标测定的研究方法，通过构建MsBAM1基因沉默的转基因紫花苜蓿植株，并对其进行冷应激和盐碱复合胁迫处理，发现MsBAM1-RNAi植株的β-淀粉酶活性、可溶性总糖含量显著降低，而总淀粉含量、丙二醛含量、超氧阴离子水平和电解质渗漏率显著升高，同时光合性能（F_v/F_m、ETR、φ_PSII）下降，表明MsBAM1基因在紫花苜蓿抵抗冷应激和盐碱复合胁迫中发挥关键作用，其沉默显著降低了植株的抗逆性。

图8. MsBAM1-RNAi苜蓿降低了对复合胁迫的耐受性。（a）MsBAM1-RNAi苜蓿在复合胁迫条件下处理7天后的表型变化，比例尺为10厘米。（b）β-淀粉酶的活性水平。（c）可溶性糖的含量。（d）淀粉的含量。（e）丙二醛（MDA）的含量。（f）超氧阴离子（O₂⁻）的含量。（g）电解质渗漏情况。（h）伪彩色荧光图像，根据右侧显示的0至1的刻度进行颜色编码。（i）光系统II的最大光化学效率（F_v/F_m值）。（j）电子传递速率（ETR）。（k）光系统II的实际光化学效率（φ_PSII）。数据为平均值±标准误（n=3）。带有不同字母的条形表示在p<0.05水平上存在显著差异。

3.结论

本研究通过整合转录组学与代谢组学技术，深入解析了紫花苜蓿（Medicago sativa L.）在盐碱与低温复合胁迫下的分子响应机制。研究结果表明，抗性品种ZD通过多层次的代谢调控与基因表达网络显著增强了其对复合胁迫的适应能力。具体而言，ZD在胁迫条件下特异性积累了异亮氨酸、延胡索酸、棉子糖等核心代谢物，并通过上调糖酵解/糖异生、黄酮类生物合成及谷胱甘肽代谢等关键途径的基因表达，构建了强大的抗氧化防御系统与渗透调节机制。