期刊名称：International Journal of Molecular Sciences
影响因子：5.6
DOI：https://doi.org/10.3390/ijms22168382
本研究以从北方引种至杭州的芍药品种“Meiju”为材料，系统探究了其地下芽休眠解除的调控机制，旨在为低纬度地区芍药推广及低需冷量品种选育提供理论基础。研究首先通过连续多年形态观察和UT模型验证，确定了“Meiju”的需冷量约为677.5冷量单位（CUs），证实其为低需冷量品种。在此基础上，研究综合运用形态学观察、生理生化测定及分子生物学手段，系统监测了从休眠诱导到解除过程中地下芽的形态动态、碳水化合物（蔗糖、可溶性总糖、淀粉）含量变化、植物内源激素水平波动、抗氧化酶活性及丙二醛（MDA）含量变化，并分析了与碳水化合物代谢、激素代谢、抗氧化代谢及休眠调控相关的关键基因（如NCED3、PP2C、ABI5、GA2ox8、DAM、CBF4等）的表达模式。研究构建了一个整合环境信号（低温）、活性氧（ROS）信号转导、碳水化合物代谢与激素代谢（特别是ABA与GA的拮抗平衡）的“Meiju”地下芽内休眠解除调控网络模型。
（1）芽休眠期和萌发期的形态学及需冷量评价
随着自然温度下降，芍药品种“Meiju”的地上部分逐渐枯萎。秋季期间，8月2日至14日期间，叶片初期有超过50%的绿叶退绿或枯萎，其地下芽进入休眠期，直至次年春季积累足够低温。新芽（图1）于3月7日至13日间在室外萌发，新出土的花蕾呈深红色。随着光合作用增强，这些芽逐渐转变为绿叶。
图1.“Meiju”花芽不同生长阶段的发育情况。“Meiju”于杭州浙江大学多年生花卉资源园（东经118°21′-120°30′，北纬29°11′-30°33′）外植栽培。（1）：11月10日；（2）：12月15日；（3）：1月11日；（4）：2月6日。
如图2A、B所示，2018年11月杭州气温开始逐渐下降，1月达到最低值，2月下旬逐渐回升。在此温度变化下，芍药地上部分于9月开始枯萎，地下芽体进入休眠状态；次年3月花色转为鲜红色，随后芽体开始萌发。图3显示，随着温度逐渐下降，分批移入温室的芍药根茎中，BPF、ANS、APW、APH和ADS的含量呈逐渐上升趋势，而WFS和WAS则随着后续的萌发和生长逐渐减少。这六个指标在1月9日都趋于稳定，之后的变化总体上不显著。
图2.（A）：“Meiju”品种休眠期地下芽的温度变化与冷量累积（采用UT模型计算冷量累积）。折线图表示日间温度，柱状图表示冷量累积值。（B）：通过UT模型评估的每日冷量累积趋势及冷害评价起始日期。（C）：最接近起始日期的地下芽切片。
图3.不同日期（具有不同自然冷量积累）转移至温室的“Meiju”植株的萌发和再生情况。蓝色虚线框表示形态指数变化足够稳定的日期。（a）WFS：温室中第一株植物萌发前的周数；（b）BPF：盆栽冠移至温室五周后的芽萌发百分比；（c）ANS：全花期成熟正常茎的平均数量；（d）APW：全花期植物平均宽度；（e）APH：全花期植物平均高度；（f）ADS：全花期茎平均直径；（g）WAS：温室中所有植物萌发前的周数。不同字母表示不同日期间存在显著差异（p<0.05）。
在对地下芽内休眠转变与解除时期的细胞学观察中发现，在休眠前阶段，地下芽细胞排列松散，分裂活动不显著；然而在内休眠解除阶段（1月9日），细胞排列紧密，细胞核颜色加深，细胞分裂活动旺盛，并且叶原基、生长点、维管束原基和芽原基中的细胞状态与前一时期相比有明显差异（图4）。截至2月26日，细胞已伸长，与内休眠阶段（11月14日）相比，其形态结构发生了显著变化。已形成明显的维管束细胞，并出现了不同的细胞形态（图4）。
图4.从内生休眠到生态休眠的“Meiju”地下芽细胞学观察。图中染色方法如下：番红固绿染色。（a–c）：叶原基；（d–f）：生长点；（g–i）：维管束原基；（j–l）：芽原基；m–o：地下芽。比例尺位于图左下角。
此外，选择每日冷量单位累积量（DACU）增加并首次转为正值的日期（2018年11月8日）作为UT模型评估的起始日期（图2B）。由于切片数量有限，采用11月14日获取的切片来展示UT模型评估起始点附近的芽细胞状态。在此期间，“Meiju”花芽的分化尚未完成（图2C）。盆栽植株移入温室的日期如图3横坐标所示。随着移栽日期的推迟，冷量逐渐累积，大多数与芽休眠、萌发和生长相关的形态指标在1月9日趋于稳定，这表明在2018-2019年冬季，“Meiju”的需冷量积累在1月9日已完成。此后，“Meiju”进入了生态休眠阶段（图2）。
对于UT模型，其起始时间定义为9月后每日冷量单位累积量增加并首次转为正值的当日凌晨0:00（11月8日）。根据形态变化，确认1月9日为内休眠消除期。根据冷量积累评估终点的定义，1月9日也是冷量能力评估的终点。采用UT模型计算，从起始点到终点的累积值为677.5冷量单位（CUs）。
（2）地下芽在休眠过程中的生理响应
本研究通过测定休眠期“Meiju”芽的蔗糖、可溶性总糖和淀粉含量，探讨其碳水化合物代谢情况。蔗糖和可溶性总糖含量逐渐增加，在1月9日碳源充足时达到峰值，随后缓慢下降。淀粉含量在整个休眠期间缓慢减少（图5）。
图5.“Meiju”花芽休眠期糖和碳水化合物含量的变化。每根柱代表平均值±标准误（n=3）。实验时间为2018年至2019年，数据由IBM SPSS Statistics 26处理。不同字母表示不同日期间存在显著差异（p<0.05）。
反式玉米醇溶蛋白-核糖苷（ZR）、吲哚-3-乙酸（IAA）、赤霉素3（GA3）和油菜素内酯（BR）的含量总体上先下降后上升，且波动程度不一。其中，ZR、IAA和GA3在1月9日达到最低值，此时“Meiju”的解除芽休眠条件已满足。然而，脱落酸（ABA）和茉莉酸甲酯（JAME）的含量在早期逐渐增加，随后在12月26日达到最高水平后迅速显著下降（图6）。这两种激素的趋势相似，均在解除休眠的关键阶段达到峰值。
图6.“Meiju”地下芽休眠期激素含量的变化。每根柱状图代表平均值±标准误（n=3）。不同字母表示不同日期间存在显著差异（p<0.05）。实验时间为2018年至2019年，数据由IBM SPSS Statistics 26处理。
为探究“Meiju”品种芽休眠与萌发过程中活性氧代谢的变化，研究人员检测了抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性以及MDA含量。总体而言，SOD活性先下降后回升，POD活性呈现相反趋势；CAT活性在内休眠期急剧上升，最终稳定在40-50ng/g水平，而MDA含量则略有增加（图7）。综合分析这四项指标可知，SOD、POD和CAT的活性均在1月9日达到峰值。
图7.不同休眠期的“Meiju”地下芽抗氧化代谢酶活性及MDA含量。不同字母表示不同日期间存在显著差异（p<0.05）。实验时间为2018年至2019年，数据由IBM SPSS Statistics 26处理。
与碳水化合物代谢（蔗糖、可溶性总糖和淀粉）、植物激素（ZR、GA3）和ROS系统（SOD、CAT）相关的指标具有较高的相关系数，可作为后续研究的重要指标（表1）。
表1.关联关键指标的相关性分析
注：符号“**”表示极显著性（p<0.01），符号“*”表示显著性（p<0.05）。背景颜色越深，相关性越显著。蓝色表示负相关，红色表示正相关。（4）“Meiju”地下芽休眠相关基因表达分析
与碳水化合物运输和代谢相关的基因（α-淀粉酶样3（AMY3）、细胞壁转化酶1（CWINV1）、淀粉合成酶3（SS3））以及与细胞发育相关的基因（蔗糖磷酸合成酶1f（SPS1F）、蔗糖合成酶3（SUS3）），其表达水平逐渐上调，并于1月23日达到最高水平，随后迅速下降。然而，磷酸果糖激酶3（PFK3）的表达在1月23日前逐渐减少。β-淀粉酶3（BMY3）和APL3基因在1月9日前未表现出显著差异表达，且保持在低表达水平。它们的表达水平在1月9日显著上调，随后迅速下降。β-葡萄糖苷酶（BGLU）和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶2（UGP2）在1月9日的表达水平最低（图8）。
图8.“Meiju”花芽休眠期间碳水化合物代谢相关基因的表达。每根柱状图代表平均值±标准误（n=3）。不同字母表示不同日期间存在显著差异（p<0.05）。实验时间从2018年持续到2019年，数据通过IBM SPSS Statistics 26处理。
拟南芥扩张蛋白6（EXPA6）、CDKB22、细胞周期蛋白d3（CYCD3）和组蛋白H1-3（HIS1-3）的表达水平在1月9日降至最低，随后逐渐上升。此外，扩张蛋白样a2（EXLA2）、拟南芥单硫谷氧还蛋白17（GRXS17）、β-1,3-葡聚糖酶3（BG3）、ARP6和过氧化氢酶2（CAT2）的表达水平短暂下调后逐渐上升，并在1月9日或1月23日达到高水平。在内生休眠早期，过氧化物酶52（PER52）的表达水平显著下降，在1月9日达到最低后未再上升（图9）。
图9.抗氧化代谢相关基因表达水平的变化。每根柱状图代表平均值±标准误（n=3）。不同字母表示不同日期间存在显著差异（p<0.05）。
与ABA合成相关的9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶3（NCED3）和NCED4基因表达量在解除内休眠前始终处于低水平，但在1月9日之后显著升高。这种现象可能源于NCEDs基因家族中不同成员在ABA合成过程中发挥着差异化作用。此外，参与ABA信号转导与代谢的C重复结合因子4（CBF4）、脱落酸响应元件结合因子2（ABF2）及ABI5基因在不同发育阶段也呈现差异表达：解除内生休眠时，CBF4和ABF2表达量显著增加，而ABI5则相对低表达（图10）。涉及赤霉素合成与代谢的基因（如GAST1蛋白同源物4（GASA4）和拟南芥赤霉素2-氧化酶8（GA2ox8））在解除内生休眠后表达量显著提升。值得注意的是，GAL-3抑制因子1（RGA1）的表达量在1月9日前持续下降。
图10.不同休眠阶段激素代谢相关基因的表达。每根柱状图代表平均值±标准误（n=3）。不同字母表示不同日期间存在显著差异（p<0.05）。
（5）不同休眠阶段中DAM-SOC1-AP1通路及其他通路的变化
图11显示了其他可能参与芍药芽休眠转换和释放的基因表达模式赤霉素不敏感矮化基因1a（GID1A）与光敏色素相互作用因子3（PIF3）的表达水平在12月12日达到峰值，此时花芽仍处于内休眠的深休眠阶段。CBF4的表达量在1月9日显著上升至最高水平。SOC1是AGL20（拟南芥AGAMOUS-LIKE 20）的别称，属于MIKC型MADS-box基因家族，与短营养期基因SVP同源，被认为具有促进花芽内休眠解除和营养生长的功能。它们的表达在1月9日至1月23日期间显著增加至最高点（图11）。SPT、RGA1和SPY的表达水平在1月9日前显著下降。
图11. DAM-SOC1-AP1通路及其它基因的表达。每个柱状图代表平均值±标准误（n=3）。不同字母表示不同日期间存在显著差异（p<0.05）。
3.结论
研究得出结论，“Meiju”的低需冷量特性（约677.5CUs）使其能较好地适应杭州等低纬度地区的冬季气候。其内休眠解除（关键时期约为1月9日）是一个受多层面因子协同调控的复杂过程。生理层面上，休眠解除伴随着淀粉分解、蔗糖和可溶性总糖含量的先升后降，以及ABA含量的下降与GA3含量的上升，ABA/GA比值的降低是休眠解除的关键信号。ROS作为重要的信号分子，其代谢酶活性在关键期发生显著变化，可能启动了休眠解除的级联反应。分子层面上，ABA代谢相关基因（NCED3、PP2C、CBF4、ABF2）在内休眠解除临界期（1月9日）表达达到峰值后迅速下降，而GA合成相关基因GA2ox8在内休眠解除早期表达显著上调。这些生理与分子事件的协同变化，最终通过DAM-SOC1-API等基因通路，促使细胞恢复分裂活性，完成休眠解除。该研究阐明了“Meiju”芽内休眠解除的调控机制，为选育低需冷量芍药新品种、推动芍药向低纬度地区引种栽培提供了重要的理论依据和实践指导。