叶片和果实的脱落作为植物生长发育的关键环节，其生理分子机制极为复杂且高度协调，涉及细胞壁降解、激素信号传导及基因表达调控等多个层面。脱落过程通常发生在特定的解剖结构——脱落区，并受到植物激素如生长素和乙烯的核心调控，同时其他激素如脱落酸、赤霉素和细胞分裂素也参与其中[1]。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，科学家们揭示了脱落过程中基因表达的动态变化，并发现转录因子在调控脱落基因表达中起关键作用[2]。尤为引人注目的是，黄酮类化合物作为植物次生代谢产物，被证实可通过抑制生长素运输参与脱落调控，为理解脱落机制提供了新视角。因此，深入探讨叶片和果实脱落的生理分子机制，不仅有助于揭示植物生长发育的基本规律，也为农业生产和作物改良提供了重要的理论依据[3]。
一．器官脱落的激素调控网络：从传统路径到多激素协同传统研究认为乙烯和生长素是调控脱落的核心激素——生长素维持“器官-母体”连接并抑制脱落，其通过极性运输在离层区形成浓度梯度，高浓度生长素可下调乙烯受体表达，从而拮抗脱落；乙烯则通过降低生长素运输速率、促进生长素响应因子（ARF）降解，削弱生长素信号，同时直接激活细胞壁降解酶基因（如多聚半乳糖醛酸酶PG、纤维素酶Cel）表达而加速脱落[4]。近年研究进一步揭示，脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）等胁迫响应激素也深度参与：ABA作为衰老信号通过SnRK2-ABF通路触发叶片老化，并上调乙烯合成酶（ACS/ACO）基因表达；JA/SA则通过COI1-JAZ和NPR1-TGA模块激活乙烯合成途径，调控活性氧（ROS）代谢（如诱导过氧化氢H2O2积累），协同促进离层区细胞壁松弛与细胞分离[5]。这些激素通过“信号感知→转录调控→酶活性调节”级联反应，最终决定了器官脱落的精确时序，其中离层区特异性转录因子（如LATERAL SUPPRESSOR、KNOX同源框基因）作为关键节点整合多激素信号，调控PG、Cel及expansin等细胞壁修饰蛋白的时空表达。
二．基于响应面法与代谢组学的苹果复合落叶剂配方优化及分子机制解析目前生产中常用的落叶剂多为尿素、乙烯利等单一成分，存在效果不稳定、受温度影响大、易导致落叶不齐等问题，如在低温（<15℃）条件下乙烯利脱落率下降50%以上，且不同植株间脱落时间差异可达7-10天，严重影响果园统一管理。复合落叶剂通过多组分协同作用可能提高效果，但其最佳配比缺乏系统优化，现有研究多停留在经验性配方筛选层面，且对植物内源激素网络的调控机制尚不明确，特别是各组分如何协同调控ABA-JA-SA-乙烯模块的交叉互作、如何影响离层区细胞壁降解酶基因（如MdPG1、MdCel1）的时序表达等关键科学问题尚未解析[6]。本研究以“烟富10”苹果为材料，采用Box-Behnken响应面法优化尿素、碘化钾和三氯乙酸三元复合配方，通过构建二次多项式模型揭示组分交互效应，并基于LC-ESI-MS/MS靶向代谢组学系统分析其对叶片ABA、JA、SA及生长素等13种激素的动态影响，结合加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定核心调控模块，旨在筛选兼顾高效性与环境稳定性的落叶剂最优配方，并阐明其通过激活乙烯合成途径、削弱生长素信号、增强胁迫激素响应以促进器官脱落的分子机制，为果树化学调控的精准化、绿色化发展提供理论依据。
期刊名称：Plant Hormones
DOI：https://doi.org/10.48130/ph-0025-0026
1.研究内容
针对全球气候变暖导致苹果树冬季落叶延迟、影响养分回流与翌年开花结果这一产业问题，系统研究了不同落叶剂对苹果落叶效果及叶片激素网络的调控机制。研究以“烟富10”苹果为试材，采用单因素试验与响应面法优化相结合的策略，筛选尿素、碘化钾和三氯乙酸（TCA）三元复合落叶剂的最佳配方，并通过靶向代谢组学解析其分子作用机理。
研究首先开展单因素试验，分别设置尿素（2%-8%）、碘化钾（0.1%-0.5%）和TCA（0.1-2g·L-1）三个浓度梯度，测定各处理喷施10天后的落叶率。结果表明，三种落叶剂的促落叶效应均呈“低促高抑”的剂量依赖性，其中尿素5%、碘化钾0.3%、TCA 1g·L-1时落叶效果最佳。继而采用Box-Behnken设计进行17组响应面优化试验，构建二次多项式回归模型（R2=0.97），精确解析三因素交互作用，确定最优配方为4.75%尿素+0.34%碘化钾+1.21g·L-1 TCA，该组合落叶率达70.91%，显著优于未优化配方的57%，且模型具有良好预测能力。
在明确配方效果的基础上，研究运用LC-ESI-MS/MS靶向代谢组学技术，对比分析了最优配方处理（T处理）、正交最优处理（R处理）和对照（CK）的叶片激素谱变化。结果显示，复合落叶剂显著上调了促衰老/脱落类激素：T处理下脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）含量较CK分别增加61.11%、81.44%和81.44%，而生长素（IAA）含量显著下降。相关性与网络分析进一步揭示，ABA与JA、SA呈强正相关（Pearson r>0.85），三者构成促脱落核心模块；加权基因共表达网络分析鉴定出SA、JA和ABA为关键枢纽代谢物，其连接的边数在T处理中显著多于R处理，表明优化配方能更强地重塑激素互作网络，增强促脱落信号协同效应。
综上，该研究不仅筛选出高效稳定的苹果复合落叶剂最优配方，更从激素调控层面阐明了其作用机制——通过协同激活ABA-JA-SA胁迫响应通路、抑制生长素信号，最终加速离层区形成与叶片脱落，为果树化学调控提供了理论支撑与实践方案。
2.样本处理
本研究于2022年11月初在中国山东省淄博市沂源县中艺果业有限公司智能果园（北纬36.07度，东经118.14度）开展。试验区属典型温带季风气候区，四季分明。试验地块土壤为壤土。实验选用树体大小及生长状况相近的健康三龄“延富10/G935”苹果树作为试验材料，所用药剂为尿素、三氯乙酸（TCA）和碘化钾（KI）纯品，均购自阿拉丁生物技术有限公司（中国上海）。处理时间为10月底至11月初，即苹果叶片在晚秋落叶前完成。每株苹果树均均匀喷施200mL落叶剂。
（1）单因素实验结果
尿素（a）、KI（b）和TCA（c）浓度对烟富10落叶率的影响如图1a-c所示。由图1可见，喷施落叶剂的苹果叶片显著脱落。随着施用浓度的增加，尿素、KI和TCA的落叶率均呈现先上升后下降的趋势。尿素添加量为5%时，苹果叶片表现出最大落叶率（图1a）。TCA浓度为1g·L-1时落叶率最高（图1b）。随着KI浓度的增加，苹果叶片落叶率逐渐提高，当KI浓度为0.3%时落叶率达到峰值，随后逐渐下降（图1c）。
图1.（a）尿素、（b）碘化钾（KI）和（c）三氯乙酸（TCA）浓度对苹果落叶率的影响。
（2）方差分析
苹果落叶剂复配方案的响应面试验设计及结果见表1。方差分析结果表明，所选模型可靠，因为模型显著且失拟项不显著（表2）。在尿素、KI和TCA三个因素中，尿素和TCA浓度对苹果叶片脱落有显著影响。此外，三因素对苹果晚秋落叶的影响并非简单的线性关系，三者之间存在显著交互作用，其中尿素与KI间的交互作用最为显著。由表3分析可知，模型的R2=0.97，校正R2=0.93，预测R2接近校正R2，信噪比为15.87（>4），表明该回归方程的拟合度和可信度较高，试验误差在可控范围内，因此该模型可用于苹果落叶剂复配方案的优化与预测。通过多元回归拟合分析，获得苹果落叶剂复配的多元二次回归方程模型：落叶率（Y）=–0.97+0.37A+4.67B–0.34C–0.29AB–0.02AC+0.51BC–0.026A2–5.93B2+0.14C2。
表1.响应面实验设计与结果
表2.模型方差分析
表3.R2综合分析
根据回归方程获得响应面图和等高线图（图2），用以分析尿素、KI和TCA复配及其交互作用对苹果落叶率的影响。随着尿素浓度和KI浓度的增加，苹果叶片落叶率发生显著变化，其促进落叶的能力先升高后降低。响应面模型确定最优组合为4.75%尿素、0.34% KI和1.21g·L-1 TCA。该最优组合的落叶促进率为70.91%，显著优于未优化落叶剂的效果（图2）。
图2.交互作用对（a）苹果落叶率的响应面图和（b）等高线图。
（4）植物叶片激素含量的变化
选取3个处理检测叶片激素含量，包括正交试验中的最优处理R：5.00%尿素、0.30% KI和1.00g·L-1 TCA，模型预测最优组合T：4.75%尿素、0.34% KI和1.21g·L-1 TCA，以及CK（无落叶剂喷施对照）。OPLS-DA结果显示，复配落叶剂处理R和T不同程度改变了植物叶片激素的类型和浓度（图3b,c）。具体而言，T处理在第一主成分中占69.2%的方差，第二主成分占10.9%，而R处理在第一和第二主成分分别解释37.1%和38.6%的方差，表明T处理对叶片激素水平的影响比R处理更为显著。喷施落叶剂后，植物叶片激素含量发生显著变化，包括脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）等含量显著升高。此外，落叶剂R和T处理后植物激素含量的变化趋势一致。在三种处理中，苹果叶片ABA和SA含量最高，而T处理叶片的JA和吲哚-3-乙酸含量显著高于R处理和CK处理，处理后吲哚-3-乙酸含量显著降低。喷施落叶剂后SA、ABA和JA含量显著增加。与CK处理相比，落叶剂R处理后叶片ABA、SA和JA含量分别增加45.65%、82.35%和82.15%，T处理后叶片ABA和SA含量分别增加61.11%和81.44%（图4）。烟富10叶片经落叶剂R处理后激素含量发生显著变化。ABA含量与JA、SA等大多数植物衰老相关激素呈显著正相关（图5a）。SA含量与吲哚-3-乙酸及戊烯腺嘌呤含量呈负相关。ABA含量与SA、JA及12-氧代植物二烯酸含量显著正相关，但与大多数植物生长激素含量呈负相关。对多种植物激素的代谢物网络分析显示，在R处理叶片中，植物激素网络包含253条正相关边和188条负相关边（图5b，c）。鉴定出的关键枢纽代谢物包括水杨酸、N,N'-二苯基脲、顺式玉米素、N-（3-吲哚乙酰基）-L-丙氨酸和茉莉酸，这些代谢物对网络中其他激素水平具有显著促进作用。相比之下，T处理叶片中植物激素网络显示262条正相关边和222条负相关边。该处理下的关键枢纽为N6-异戊烯基腺嘌呤、水杨酸、（+）-脱落酸、N-（3-吲哚乙酰基）-L-亮氨酸和茉莉酸（图6）。值得注意的是，这些关键枢纽连接的边数在T处理网络中多于R处理网络。结果表明，T处理显著提高了脱落酸和水杨酸等促进脱落激素的含量，并增强了它们与其他植物激素的正相关关系。苹果落叶率分析显示，KI、TCA和尿素与苹果落叶呈显著正相关（图7）。其中，TCA和尿素含量的变化对苹果落叶率变化影响更为显著，基于Pearson相关系数计算二者相关性，R值分别为0.94和0.97，表明模型具有强线性关系，p值分别为0.00046和4.7e-06，表明线性关系极显著。其中尿素含量的线性变化与苹果落叶率相关性更显著。对落叶剂活性成分与植物落叶直接相关的ABA含量进行相关性分析显示，三种落叶剂与植物叶片ABA生成具有强正相关，R值均大于0.95，表明模型线性关系极显著。
图3.落叶剂对叶片植物激素含量影响的热图。（a）不同处理间激素含量差异。（b）T处理vs CK的OPLS-DA分析。（c）R处理vs CK的OPLS-DA分析。
图4.落叶剂对叶片植物激素含量的影响。（a）T处理对苹果叶片植物激素的影响。（b）R处理对苹果叶片植物激素的影响。（c）T处理下苹果叶片中变化最显著的前三种激素含量。（d）R处理下苹果叶片中变化最显著的前三种激素含量。*的数量表示处理间差异显著性，**p<0.05，***p<0.001。
图5. R处理与CK处理的相关性。（a）R处理下苹果叶片植物激素间的相关性。（b）R处理下苹果叶片植物激素相关性网络。（c）共线性网络的边属性。（d）R处理与CK处理间无显著差异的关键节点（p>0.05）。
图6. T处理与CK处理的相关性。（a）T处理下苹果叶片植物激素间的相关性。（b）T处理下苹果叶片植物激素相关性网络。（c）共线性网络的边属性。（d）T处理与CK处理间无显著差异的关键节点（p>0.05）)。
图7.落叶剂含量与落叶率及ABA含量的相关性分析。
3.结论
该研究通过单因素与响应面法优化，确定了4.75%尿素、0.34%碘化钾（KI）与1.21g·L-1三氯乙酸（TCA）的复合落叶剂最佳配方，其喷施10天后苹果叶片脱落率达70.91%，显著优于传统单一成分制剂，且有效解决了低温条件下效果不稳定及植株间脱落时间差异大的问题；机制上，该配方通过显著提升叶片中脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）含量（分别增加46.65%、82.15%和82.35%），同时降低生长素水平，激活乙烯合成途径并削弱生长素信号，进而促进离层区细胞壁降解酶基因的时序表达，最终实现叶片脱落；研究不仅为果树化学调控的精准化与绿色化提供了理论依据，还揭示了多激素协同调控器官脱落的分子机制，推动了植物激素调控网络研究的深入发展。
参考文献：
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