期刊名称：Soil Biology and Biochemistry
影响因子：10.3
DOI：https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2026.110107
探究了土壤酶活性测定的最优储存方式，旨在解决储存方式缺乏标准化导致的研究数据难以交叉比较的问题。研究选取冷藏（2-7℃）、冷冻（−5至−35℃）、风干（室温≈24℃）三种储存方式，以采样24小时内的新鲜土壤为参照，分析了β-葡萄糖苷酶（βG）、磷酸单酯酶（PME）等四种水解酶活性的响应，共纳入22篇研究的106种土壤，其中酸性土壤占86%，氧化土和软土为主要土壤类型。
研究发现，冷藏和冷冻对βG、PME、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶（NAG）活性的降低作用显著低于风干，脲酶（UE）仅在冷藏下活性下降8%；酶活性变化多与储存方法、测定方法相关，与储存时长关联较小，仅冷藏下βG活性随时间持续降低。荧光法测定的酶活性受储存影响更大，土壤pH、黏土、有机碳含量对储存效应的调控作用无一致规律，不同土壤分类的酶活性响应也存在差异。此外，研究指出当前文献存在数据缺口、测定方法和参照标准不统一等问题，风干法的相关数据尤为不足。综合来看，没有储存方法能完全保留新鲜土壤的酶活性，结合土壤性质和测定方法，比色法测定βG活性宜采用≤3天的冷藏，荧光法测定βG和PME活性则冷冻储存为最优选择。
从最终纳入的22篇研究中，为每个土壤样品提取以下数据：1）储存后土壤酶活性均值；2）田间鲜样（取样后≤24小时）酶活性均值；3）酶活性的标准差或标准误；4）重复数。若研究报道了储存时长，则记录相关数据（包括多个时间点的时长）；若报道了风干时长，则将其纳入储存时长。取样后24小时内测定的酶活性，包含取样后<2、3、4、15小时的测定数据。若研究中仅提及“取样后立即测定”“无储存鲜土”或“当日测定”，未报道具体时间，则默认酶活性测定在取样后≤24小时完成。若研究中提及在鲜土中测定酶活性，但未标注“立即”或“鲜样”，则默认采用冷藏储存—这是因为实验室中通常会将土壤样品短期冷藏后再测定酶活性，而非室温储存。
（1）土壤储存对酶活性影响研究的气候、土地利用、土壤类型及性质分布特征
评估储存对βG、PME、NAG、UE活性影响的22篇文献，其研究区域主要集中在南北美洲和欧洲。所评估的106种土壤均来自热带和温带气候区，涵盖多种农业和非农业土地利用方式（表1）。106种土壤中，氧化土占比最高（34%），其次为软土（19%），其余36%为浅成土、初成土、赤红壤、棕钙壤、干旱土和灰土。由于原文中未提供或无法从采样地点信息中推导，11%的土壤缺乏最高分类水平（美国农业部分类）的土壤类型信息。88%的文献报道了固定的土壤取样深度（0~25cm），11%为发生层取样（均为A层）（A层是土壤发生层中的一个重要层次，主要指腐殖质层或受耕作影响的表层。它是土壤剖面的最上层，也是植物根系和微生物活动最活跃的区域）。大多数土壤取样深度主要为0~10cm（50%）和0~15cm（24%）。有2篇文献研究了12种A层土壤的酶活性，但未报道取样深度，且涉及多种土壤类型（如浅成土、软土、灰土），因此其取样深度可能存在差异。94%的土壤（n=99）报道了pH值，且以酸性土壤为主（80%，pH<7）（表2）；仅20%的土壤pH≥7，且这类土壤主要用于评估风干相对于冷藏处理的酶活性响应（pH≥7的土壤中90%）。78%的土壤报道了黏粒含量，变异范围达22倍（3~66%）。除砂土、粉土、粉质黏土外，涵盖美国农业部土壤质地分类的所有类型。60%的土壤报道了有机碳（OC）含量，变异范围近27倍（7.2~192g kg-1]）。84%的湿润土壤（田间鲜样、冷藏、冷冻处理，n=106）和88%的风干土壤（n=93），在酶活性测定或储存前进行过筛处理，过筛孔径为未知、<2mm、4mm或9mm。
表1.来自22篇研究文章（n=106个土壤样本）的元数据集中，研究了国家、气候、土地利用和土壤分类，以及βG、PME、NAG和UE活性对土壤储存方法的响应。这些储存方法包括冷藏（将田间湿土壤储存在2至7°C之间）、冷冻（将田间湿土壤储存在-5至-35°C之间）以及风干（将土壤储存在室温下，假定在干燥后温度约为24°C）。由于部分研究文章包含来自多种土地利用类型和土壤分类的土壤，因此土地利用和土壤分类的文章总比例超过100%。
a根据柯本分类法的主要气候类型（柯本分类法经多次修订（如柯本-盖格尔-波耳方案），广泛用于气候研究、生态保护及农业规划。例如，中国可划分为南方温暖区（Cfa、Cwa）、北方冷温区（Dwa、Dwb）、西北干旱区（Bsk、Bwk）和青藏高原区（ETH））。
b未报告或无法从研究文章中得出的土壤数量和比例以及研究文章数量。
表2.来自22篇研究文章的元数据中土壤pH值、粘土和OC（有机碳）的描述性统计（n=106个土壤样本），用于评估βG、PME、NAG和UE活性对土壤储存方法的响应：冷藏（在2至7°C储存田间湿土）、冷冻（在-5至-35°C储存田间湿土）和风干（在室温下储存土壤，假定约为≈24℃，干燥亦在相同温度下进行）下的情况。
a未报告土壤性质的土壤数量及研究文章数量（占总数的百分比）。
（2）土壤储存对酶活性的影响
整体而言，冷藏和冷冻处理下βG、PME、NAG活性的降幅较小，风干处理降幅较大，仅冷藏处理对UE活性存在显著降低作用（图1）。βG和PME活性的降幅随储存方法和测定方法的变化特征相似，比色法测定的βG（9%）和PME（7%）活性在冷藏处理下的降幅最小。冷藏处理下，荧光法测定的βG（17%）和PME（16%）活性降幅略高于比色法。冷冻处理下，荧光法测定的βG和PME活性降幅与冷藏处理相近。但比色法测定的βG活性降幅为冷藏处理的4倍，PME活性为6倍。NAG活性在冷藏和冷冻处理下的降幅相近（33%~45%），且受测定方法影响。比色法测定的NAG活性降幅为荧光法的1.5倍。无论是相对于田间鲜样（图1）还是冷藏处理，风干土壤中荧光法测定的βG（55%~57%）、PME（53%~57%）和NAG（59%~68%）活性降幅均达到最大。有1篇文献针对2种土壤（软土、浅成土）的研究表明，相对于田间鲜样，风干处理对比色法测定的βG和PME活性无显著影响。但在更大样本量下（5~36种土壤），相对于冷藏处理，风干土壤中比色法测定的βG活性下降16%、PME活性下降73%。目前尚无观测数据（n=0）评估相对于田间鲜样时，风干处理对比色法测定NAG活性的影响。但1篇文献针对2种软土的研究表明，相对于冷藏处理，风干处理对比色法测定的NAG活性无显著影响，尽管其置信区间较大（-78%~1554%）。UE活性在冷藏处理下下降8%，但冷冻和风干处理对其无显著影响，且UE活性的响应变化较高（置信区间-20%~27%）。 储存时长对土壤酶活性的影响仅体现在冷藏处理下对βG活性的影响。冷藏条件下，βG活性每周下降2.2%（荧光法，Pfluorogenic<0.01，R2=0.17）至2.9%（比色法，Pchromogenic<0.001，R2=0.30）（图2）。冷冻（Pfluorogenic0.26；=Pchromogenic0.10）和风干（荧光法Pfluorogenic0.61，比色法观测数据不足）处理下，土壤βG活性与储存时长无显著相关性。对于PME、NAG、UE，无论采用何种储存方法和测定方法，其活性均与储存时长无显著关联。图1.酶活性对土壤储存的响应相对于鲜土壤（采样后≤24小时内测定）的活性进行计算，数据来自22篇研究文章的106个土壤样本。储存方法包括冷藏（将田间湿土存放在2至7°C之间）、冷冻（将田间湿土存放在−5至−35°C之间）和风干（将土壤在室温下储存，假设≈24°C，并进行相同温度的干燥）。荧光法和比色法是测定βG、PME、NAG活性的两种检测方法，差异在于底物类型以及底物与土壤的结合方式。总体指的是βG、PME、NAG在不同测定方法下的活性变化。脲酶活性用尿素作为底物进行测定。对于每组观测数据，n=土壤样本数，括号内为研究文章数量。误差线表示95%的置信区间。
图2.土壤βG活性对冷藏期间持续时间的响应（储藏时土壤保持湿润，温度在2-7°C之间），相对于新鲜土壤（取样≤24小时内测定）的活性，数据来源于6篇研究文章的20个土壤样本。荧光法和比色法分别指两种测定方法，它们在底物及底物与土壤的结合方式上有所不同。P值表示用于评估储藏时间与酶活性百分比变化关系的线性回归的显著性。R2值表示线性回归模型解释的方差比例，分别适用于两种测定方法。
在低温保存条件下，βG活性的下降在各类土壤性质中比冷冻保存和风干更为一致（图3）。冷藏处理下，比色法测定的βG活性降幅与土壤pH、黏粒、OC含量均无显著关联。相反，荧光法测定的βG活性在pH<5.5（土壤酸性）下降了16%、高黏粒（≥350g kg⁻¹）下降了18%、高OC（≥40g kg⁻¹）下降了20%，但在pH≥5.5、低黏粒（<350g kg⁻¹）、中OC（16~40g kg⁻¹）土壤中无显著变化。冷冻处理下，比色法测定的βG活性在pH<5.5土壤中下降36%，但在pH≥5.5土壤中无显著变化，低黏粒土壤的降幅为高黏粒土壤的2倍，在低OC土壤下降了43%，但在中OC土壤无显著变化。冷冻处理下，荧光法测定的βG活性在高OC土壤中显著下降21%，但在中OC土壤无显著变化，且降幅与土壤pH、黏粒含量无显著关联。风干处理下，荧光法测定的βG活性在pH≥5.5土壤中的降幅为pH<5.5土壤的1.6倍；低黏粒土壤为高黏粒土壤的2倍；因所有土壤OC水平接近，无法评估OC对风干处理下荧光法βG活性的影响。风干处理下，比色法测定的βG活性降幅与OC含量无显著关联；因缺乏pH<5.5和高黏粒土壤的观测数据，无法评估pH和黏粒对其的影响。
图3.土壤βG对土壤储存的响应，相对于新鲜土壤中的活性（采样≤24小时内测定），按土壤性质（pH值、粘土、有机碳（OC））和测定方法（荧光法vs比色法）分类。数据来源于22篇研究文章中的106份土壤样品，计算了酶活性对土壤储存的响应。储存方法为：（a）冷藏（将田间湿土壤储存在2-7℃之间），（b）冷冻（将田间湿土壤储存在−5至−35℃之间），（c）风干（在室温下储存土壤，假设储存温度约为24°C，干燥也在同一温度下进行）。低粘土（粘土<350g kg-1）、高粘土（粘土≥350g kg-1）、低OC（OC<16g kg-1）、中OC（16<OC<40g kg-1）、高OC（OC≥40g kg-1）。
与βG相似，冷藏处理下PME活性的降幅在不同土壤性质间的一致性，高于冷冻和风干处理（图4）。冷藏处理下，比色法测定的PME活性降幅（6%~10%）与土壤pH、黏粒含量无显著关联。在冷藏条件下，比色法测定的PME活性在OC含量低的土壤中下降了10%，但在中等至高OC的土壤中无显著变化。冷藏处理下，荧光法测定的PME活性在pH<5.5土壤中下降17%，pH≥5.5土壤无显著变化；高OC土壤的降幅为中OC的4倍，高黏粒土壤为低黏粒的4倍。冷冻处理下，荧光法测定的PME活性降幅（13%~20%）与土壤性质无显著关联；比色法测定的PME活性在pH<5.5土壤中的降幅为pH≥5.5土壤的2.5倍，且与黏粒含量无显著关联；在冷冻储存下，低OC土壤的比色法测定PME活性下降了49%，低OC土壤下降49%，中OC土壤无显著变化。风干处理下，荧光法测定的PME活性在pH<5.5土壤中的降幅为pH≥5.5的1.5倍，高黏粒土壤为低黏粒的1.5倍；因所有土壤均为中OC水平，无法评估OC的影响。风干处理下，比色法测定的PME活性降幅与OC含量无显著关联；因缺乏pH<5.5和高黏粒土壤的观测数据，无法评估pH和黏粒的影响。
图4. PME活性对土壤储存的响应，相对于现场新鲜土壤（采样后≤24小时测定）的活性，按土壤性质（pH、粘土、有机碳（OC））和测定方法（荧光法vs比色法）分类，从22篇研究文章中106个土壤样本计算得出酶活性对土壤储存的响应。储存方法为：（a）冷藏（将田间湿土壤储存在2至7℃之间），（b）冷冻（将田间湿土壤储存在−5至−35℃之间），（c）风干（在室温下储存土壤，假设储存温度约为24°C，干燥也在同一温度下进行）。低粘土（粘土<350g kg-1）、高粘土（粘土≥350g kg-1）、低OC（OC<16g kg-1）、中OC（16<OC<40g kg-1）和高OC（≥40g kg-1）。
冷藏和冷冻处理下NAG活性的受土壤性质调控特征相似，而风干处理下NAG活性的降幅在不同土壤性质间的一致性更高（图5）：冷藏和冷冻处理下，比色法测定的NAG活性在pH<5.5土壤中下降44%~47%，pH≥5.5土壤无显著变化；低黏粒土壤的降幅为高黏粒的2倍；低OC土壤下降47%，中OC土壤无显著变化。冷藏处理下，荧光法测定的NAG活性降幅与土壤pH、黏粒含量无显著关联；冷冻处理下，pH<5.5土壤的降幅为pH≥5.5的3倍，且与黏粒含量无显著关联。冷藏和冷冻处理下，荧光法测定的NAG活性在中OC土壤中的降幅（47%）显著高于高OC土壤（15%）。风干处理下，荧光法测定的NAG活性在pH<5.5土壤中的降幅为pH≥5.5的1.6倍，且与黏粒含量无显著关联；因观测数据不足，无法评估OC对荧光法NAG活性的影响，也无法评估土壤性质对比色法NAG活性的影响。
图5. NAG活性对土壤储存的响应，相对于现场新鲜土壤（采样后≤24小时测定）的活性，按土壤性质（pH值、粘土、有机碳(OC)）和测定方法（荧光法与比色法）分类，数据来自22篇研究文章中的106个土壤样本，用于分析酶活性对土壤储存的响应。储存方法为：（a）冷藏（将田间湿土壤储存在2至7℃之间），（b）冷冻（将田间湿土壤储存在−5至−35℃之间），（c）风干（在室温下储存土壤，假设储存温度约为24°C，干燥也在同一温度下进行）。低粘土（粘土<350g kg-1）、高粘土（粘土≥350g kg-1）、低OC（OC<16g kg-1）、中OC（16<OC≤40g kg-1）、高OC（≥40g kg-1）。
与βG、PME、NAG相比，UE活性受储存的影响更小，仅出现轻微且少量的降幅，且降幅大多与土壤pH、黏粒、OC含量无显著关联（图6）：冷藏处理下，UE活性在pH≥5.5土壤中的降幅（20%）高于pH<5.5土壤（7%），且与黏粒、OC含量无显著关联（整体降幅8%）。冷冻处理下，UE活性在pH<5.5且高黏粒的土壤中下降68%，但在pH≥5.5且低黏粒的土壤中无显著变化。风干处理下，UE活性降幅与OC含量无显著关联；因缺乏pH<5.5和高黏粒土壤的观测数据，无法评估pH和黏粒的影响。冷冻和风干处理下UE活性的响应变异度较高（置信区间-57%~133%），而冷藏处理的变异度相对较小（置信区间<±10%），且该特征与土壤性质无关。
图6. UE活性对土壤储存的响应，相对于新鲜田间土壤（采样≤24小时内测定）的活性，按土壤性质（pH值、粘土含量、OC）和测定方法（荧光法与比色法）分类计算，数据来自22篇研究文章的106个土壤样本，用于分析酶活性对土壤储存的响应。储存方法为：（a）冷藏（将田间湿土壤储存在2至7℃之间），（b）冷冻（将田间湿土壤储存在−5至−35℃之间），（c）风干（在室温下储存土壤，假设储存温度约为24°C，干燥也在同一温度下进行）。低粘土（粘土<350g kg-1）、高粘土（粘土≥350g kg-1）、低OC（OC<16g kg-1）、中OC（16<OC<40g kg-1）以及高OC（OC≥40g kg-1）。
（4）土壤类型对储存酶活性影响的调控作用
相较于氧化土、淋溶土、新成土、灰土，软土和老成土中荧光法和比色法测定的βG活性，对储存方法的响应更显著：冷藏处理下，软土中荧光法测定的βG活性降幅最大（26%），而比色法无显著变化；氧化土、老成土、淋溶土、新成土中，βG活性对冷藏处理的响应相似（降幅3%~15%或无显著变化），且与测定方法无关。冷冻处理下，老成土中比色法测定的βG活性降幅最大（45%）；软土、氧化土、老成土、淋溶土、新成土、灰土中，βG活性对冷冻处理的响应相似（降幅10%~23%或无显著变化），且与测定方法无关。风干处理下，软土和老成土中荧光法测定的βG活性降幅最大（60%），其次为灰土（24%）；软土和新成土中比色法测定的βG活性，受风干处理无显著影响。
冷藏和冷冻处理下，软土、老成土、氧化土中荧光法和比色法测定的PME活性降幅最大；风干处理下，软土、淋溶土、老成土中荧光法测定的PME活性降幅最大：冷藏处理下，软土中荧光法测定的PME活性降幅最大（40%），其次为老成土（16%）；软土、氧化土、老成土、淋溶土中比色法测定的PME活性对冷藏处理的响应相似（降幅7%~16%或无显著变化）；与其他土壤类型不同，新成土中荧光法测定的PME活性在冷藏处理下显著升高42%。冷冻处理下，老成土（48%）和氧化土（42%）中比色法测定的PME活性降幅最大；软土、老成土、淋溶土、新成土、灰土中，荧光法测定的PME活性对冷冻处理的响应相近或略有差异（降幅8%~26%）。风干处理下，软土和淋溶土中荧光法测定的PME活性降幅最大（62%~67%），其次为老成土（47%）、灰土（33%）；软土和新成土中比色法测定的PME活性，受风干处理无显著影响。
NAG活性对冷藏和冷冻处理的响应，随土壤类型的变异更大，而风干处理的变异相对较小：冷藏和冷冻处理下，淋溶土中荧光法测定的NAG活性降幅最大（76%），其次为老成土（55%）和氧化土（32%）的比色法测定值，以及软土和老成土（24%）的荧光法测定值；软土和淋溶土中比色法测定的NAG活性，受冷藏/冷冻处理无显著影响；新成土中，荧光法测定的NAG活性在冷藏处理下升高31%，但冷冻处理无显著变化。风干处理下，软土中荧光法测定的NAG活性降幅最大（72%），其次为老成土（65%）；淋溶土、新成土、灰土的降幅最小且相近（53%）。
与βG、PME、NAG相比，不同土壤类型下UE活性对储存响应的观测数据更少：淋溶土中UE活性在冷冻（68%）和冷藏（45%）处理下的降幅最大；冷藏处理下，老成土（11%）和氧化土（5%）的UE活性显著下降，而冷冻处理对老成土无显著影响；软土的UE活性受所有储存方法均无显著影响，新成土的UE活性受风干处理无显著影响。
3.结论
该文献针对土壤酶活性测定缺乏标准化储存方法的问题，系统整合22篇研究、106种土壤的相关数据，量化分析了冷藏（2~7℃）、冷冻（-5~35℃）、风干（≈24℃）三种储存方式对βG等四种水解酶活性的影响，并探究了土壤性质、测定方法等对储存响应的调控作用。研究发现，供试土壤以酸性土为主，氧化土和软土占比最高，土壤储存对酶活性的影响具有酶特异性与测定方法特异性：冷藏对βG、PME活性降幅最小，冷藏和冷冻均能有效减少NAG活性损失，仅冷藏会轻微降低UE活性，而风干处理对前三种酶活性的抑制作用最显著。除冷藏下βG活性随储存时长持续下降外，其余酶活性的储存响应与时长无关，且土壤pH、黏粒、OC含量对储存效应的调控作用整体不一致。荧光法与比色法测定的酶活性对储存的响应存在明显差异，荧光法测定的酶活性受储存影响更大。研究还指出，现有文献存在风干处理数据不足、参照标准不统一、测定方法差异等问题，限制了结果的跨研究对比。基于研究结果，建议比色法测定βG采用≤3天的冷藏储存，荧光法测定βG和PME选择冷冻储存，为土壤酶活性测定的样本储存标准化提供了关键依据。