期刊名称：Chemosphere

影响因子：8.1

DOI：https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2024.142289

本文以尼罗罗非鱼为实验模型，系统研究无机砷（As（Ⅲ）、As（Ⅴ））在鱼体肝脏、胃、鳃、肌肉四种组织中的生物富集与生物转化特征，并评估Se（Ⅳ）对砷毒性的拮抗效应。研究设置5mg/L和10mg/L两个砷暴露浓度，开展1天和7天静态暴露实验，采用ICP-MS测定总砷含量，利用LC-ICP-MS进行As（Ⅲ）、As（Ⅴ）、MMA、DMA、AsB的形态分析。结果显示，As（Ⅲ）与As（Ⅴ）暴露后，鱼体组织砷富集量均呈现肝脏＞胃＞鳃＞肌肉的规律，且As（Ⅲ）的生物富集能力显著高于As（Ⅴ）。无机砷在鱼体内可发生氧化还原与甲基化转化，最终生成无毒的AsB并成为主要赋存形态。在砷硒联合暴露实验中，1mg/L Se（Ⅳ）可显著降低罗非鱼各组织的砷富集量，使砷毒性降低4～6倍。该研究明确了砷在罗非鱼体内的富集分布、代谢转化路径，证实硒对砷毒性具有明显拮抗作用，为水生环境砷污染风险评估与水产安全防控提供了实验依据。

实验选用健康尼罗罗非鱼幼鱼，经21天驯化后分为砷单独暴露组（As（Ⅲ）、As（Ⅴ），浓度分别为5mg/L、10mg/L，暴露1天、7天）与砷硒拮抗组（As（Ⅲ）+1mg/L Se（Ⅳ），相同浓度与时间），每组5尾鱼独立暴露；暴露结束后以苯佐卡因麻醉，解剖采集肝脏、胃、鳃、肌肉组织，于-80℃保存；用于总砷、总硒检测的样品经冷冻干燥、均质后，采用硝酸-过氧化氢体系微波消解，冷却定容后待测；用于砷形态分析的样品则用稀硝酸加热提取、离心、稀释、过滤后供LC-ICP-MS检测。

（1）砷的生物累积

As（Ⅲ）与As（Ⅴ）暴露后尼罗罗非鱼不同组织总砷含量见表1。与对照组相比，暴露于5和10mg/L As（Ⅲ）与As（Ⅴ）暴露组鱼体组织砷生物累积量均呈上升趋势。As（Ⅲ）暴露组中，肝脏、胃、鳃、肌肉的砷浓度范围分别为2.80~20.7μg/g、0.69~19.1μg/g、0.15~4.66μg/g、0.08~4.88μg/g；As（Ⅴ）暴露组中，肝脏、胃、鳃、肌肉的砷浓度范围分别为0.09~15.7μg/g、0.10~6.48μg/g、0.13~3.55μg/g、0.27~2.28μg/g。人工饲料中砷浓度低于电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）的定量限（2.2×10^-4mg/L），表明驯化期饲料不影响组织砷积累。

表1.不同组织的尼罗罗非鱼在暴露于As（III）和As（V）后的总砷浓度（n=3；平均值±标准差）。

D1：暴露1天。D7：暴露7天。暴露1天后，10mg/L As（Ⅲ）组肝脏砷含量显著高于5mg/L组（图1b）。尽管其他试验条件下的差异无统计学意义，但均呈现相同趋势。10mg/L As（Ⅲ）暴露组鱼体所有组织的砷生物累积量均为最高（图1）。所有组织中As（Ⅲ）生物积累的最低和最高水平分别出现在暴露1天的5mg/L和暴露7天的10mg/L，肝脏除外，其最高浓度出现在暴露1天的10mg/L。

图1.尼罗罗非鱼不同组织在暴露于As（III）后的砷生物累积量。

As（Ⅴ）暴露组统计显示，暴露1天后，10mg/L组鱼体胃和鳃的砷浓度与5mg/L组相比显著升高（图2a和c）；肝脏和肌肉中也呈现相同趋势，但差异无统计学意义。与As（Ⅲ）暴露组一致，As（Ⅴ）暴露组中所有组织的砷生物累积量均以5mg/L暴露1天组最低。而各组织的砷浓度峰值存在差异：胃和鳃中，10mg/L暴露1天组的砷浓度最高（图2a和c）；肌肉中，10mg/L暴露7天组的砷浓度最高（图2d）；肝脏中，5mg/L暴露1天组的砷浓度最高（图2b）。

图2.不同组织中尼罗罗非鱼在暴露于As（V）后砷生物积累量。As：砷。D1：暴露1天。D7：暴露7天。*指示组之间的统计学显著差异。三个重复实验的代表值以均值加标准误（±SEM）表示。p<0.05表示具有统计学显著性。

描述性分析表明，As（Ⅲ）与As（Ⅴ）暴露下，砷生物积累量均遵循肝脏>胃>鳃>肌肉的规律。正如Tsai等报道的，肝脏和胃具有最大吸收该污染物的能力，这些器官在慢性暴露条件下充当As长期储存的部位。

肝脏是最推荐用于研究水生环境污染的组织。它显示出最高的污染物浓度，并且是负责As代谢和毒性的主要器官。由于其解剖和生理特性，如脂质组成、高代谢活性以及大量血液供应，肝脏是一个可以积累大量砷的器官，表明其在可能的生物转化过程中具有重要性。

对两种生物富集测定获得的描述性结果显示，鳃和肌肉组织的砷浓度最低，这与文献中报道的多项研究一致。在Tsai和Liao的研究中，将罗非鱼暴露于1mg/L的AS持续7天后，也在鳃和肌肉中发现了最低的砷浓度。Ferreira等人使用尼罗罗非鱼进行生物积累测定，使用固定浓度为1mg/L的As（Ⅲ）和As（Ⅴ），实验时间分别为1、4和7天。在所有情况下，鳃和肌肉中也观察到了最低的砷浓度。Cui等人使用金鱼进行实验，通过饮食暴露于砷，持续时间为10天和20天，其中肌肉中的砷浓度最低，而肝脏、肾脏、脾脏和肠道组织的砷浓度较高。

Schlechtriem等观察到污染物积累与组织脂质含量之间存在显著正相关。因此，肝脏的脂肪含量可以解释As浓度比肌肉组织更高的原因，因为肌肉组织的脂肪含量低，导致砷的生物累积较低。

在不同的尼罗罗非鱼组织中，当鱼暴露于As（Ⅲ）时，砷的生物累积比暴露于As（Ⅴ）时更高，这可能归因于As（Ⅲ）和As（Ⅴ）吸收过程的不同。结果表明，与As（Ⅴ）相比，当鱼暴露于高浓度砷时，As（Ⅲ）更容易穿过上皮或在组织中更容易被代谢。Zhang等也报告了类似的发现。在水体暴露后，孟买牡蛎中As（Ⅲ）的生物利用度高于As（Ⅴ）。

（2）砷形态分析

本研究采用标准物质验证样品前处理和分析方法的准确度。需要注意的是，固体基质中砷的形态分析难度较大，分析全过程需保证砷形态的完整性，因此提取方法的选择是形态分析的关键步骤。样品前处理后，需保证溶液中砷形态的稳定性，避免目标形态的测定结果出现偏低或偏高的情况。

图3显示了五种砷物种标准品[AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA和As（Ⅴ）]的色谱图，LC-ICP-MS的操作条件能够在12分钟的运行时间内实现不同砷形态的有效分离。使用标准品（CRMs）进行物种分析的结果如表2所示，并与认证值进行了比较。通过分析CRMs（DOLT-5、DORM-4和TORT-3）评估了分析方法的准确性。通过比较提取物中所提取物种的质量分数总和与ICP-MS测定的提取物中总砷质量分数进行了砷的质量平衡。结果（表2）与认证砷值一致，置信区间为95%。AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA和As（Ⅴ）的定量限分别为14.6、76.4、98.4、68.5和23.7ng/g。所有CRMs以及提取后样品的色谱图如图4所示。

表4.标准品（DOLT-5、DORM-4和TORT-3）中总砷及砷形态的质量分数。

认证值：DOLT-5=34.6±2.4μg/g；DORM-4=6.80±0.64μg/g；TORT-3= 59.5±3.8μg/g。

图3.在LC-ICP-MS方法中，使用浓度为10mmol/L的(NH₄)₂HPO₄，稀释于1%（v/v）甲醇中作为流动相，对As物种进行色谱分离。AsB：甜菜碱砷。As（III）：三价砷。DMA：二甲基砷。MMA：一甲基砷。As（V）：五价砷。

用于CRM样品砷形态分析的色谱图（图4）显示，在DOLT-5、DORM-4和TORT-3中AsB形态占主导。观察到DMA的存在，而As（Ⅲ）、MMA和As（Ⅴ）低于定量限（LOQ）。使用CRM获得的平均浓度值表明，样品制备方法是可接受的，并可用于真实样品的分析，如图4d所示。使用HNO₃（0.03mol/L）在90°C下提取40分钟，从CRM中获得的平均回收率在89%到94%之间，因此该方法被用于生物组织样品的制备。

图4.（a）DOLT-5,（b）DORM-4,（c）TORT-3和（d）实际样品的色谱图。AsB：甜菜碱砷。As（III）：三价砷。DMA：二甲基砷。MMA：一甲基砷。As（V）：五价砷。

以前的研究中也报道了使用稀酸溶液提取砷形态的方法，结果显示提取效率良好，同时不会影响砷形态的稳定性。Goessler和Pavkov研究了砷形态在暴露于硝酸、高温等条件下的化学稳定性。

研究发现，DMA、TMAO和四甲基砷离子（TETRA）在200℃时都很稳定；MA在约140℃时开始分解为As（Ⅴ）；AsB在约100℃时稳定；AsC在较低温度下开始分解为TMAO和TETRA，在100℃时仍有60%的AsC未被分解。因此，当使用硝酸等相对强烈的萃取剂时，砷的主要形态（除了可能被氧化为As（Ⅴ）的As（Ⅲ）之外）在使用酸性条件和相对低温（<100℃）的萃取过程中不会发生变化。Foster等采用不同方法（水、正磷酸、甲醇-水和稀硝酸）对植物和海洋动物组织中的砷进行了定量提取。其中使用2%（v/v）HNO₃并在微波炉中以95℃加热6分钟可获得最佳回收率。Schmidt等人提出了一种简单方法，使用0.03mol/L HNO₃溶液在加热块中以100℃加热30分钟，从海产品样品中提取砷形态，CRM的回收率在94%到103%之间，并且对AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA和As（Ⅴ）具有良好的准确性。

因此，上述结果表明，本研究开发的提取方法和LC-ICP-MS方法具有广泛的适用性、优异的准确性以及对复杂样品基质的适应能力，适用于准确测定用于人类消费的鱼类中的砷形态。

（3）砷的生物转化

生物转化是指生物体内的物质在酶的介导下发生化学反应，转化为另一种毒性更低的化合物的过程。砷的生物转化主要包括三种方式：（1）As（Ⅲ）和As（Ⅴ）之间的氧化还原转化；（2）As（Ⅴ）还原为As（Ⅲ）；（3）砷的甲基化，生成MMA和DMA代谢产物，随后转化为砷AsB。本研究为尼罗罗非鱼不同组织中砷的生物转化机制提供了新的研究思路，表3和表5分别为尼罗罗非鱼暴露于As（Ⅲ）和As（Ⅴ）后，各组织中五种砷形态的质量分数。

表3.不同组织中尼罗罗非鱼暴露于As（III）后总As浓度。

表4.不同组织中尼罗罗非鱼暴露于As（Ⅴ）后总As浓度。

尼罗罗非鱼暴露于As（Ⅲ）后（表3），所有组织中均检测到As（Ⅴ），说明尼罗罗非鱼可将As（Ⅲ）氧化为As（Ⅴ）。微生物中已发现As（Ⅲ）氧化为As（Ⅴ）的现象，但鱼类中的相关研究较少。Rahman和Hassler报道，微生物的As（Ⅲ）氧化机制包括化能自养代谢，其中As（Ⅲ）被用作能量来源，以及由亚砷酸氧化酶介导的细胞外As（Ⅲ）氧化。然而，鱼类中As（Ⅲ）氧化的机制尚不清楚，需要进一步研究。

尼罗罗非鱼暴露于As（Ⅴ）后（表4），所有组织中均检测到As（Ⅲ），说明鱼体内发生了As（Ⅴ）还原为As（Ⅲ）的反应。由于As（Ⅴ）和磷酸盐的理化性质相似，As（Ⅴ）可通过磷酸盐转运系统进入细胞，随后在亚砷酸还原酶的催化下，伴随谷胱甘肽（GSH）氧化为二硫化谷胱甘肽（GSSG），As（Ⅴ）被还原为As（Ⅲ）。As（Ⅴ）的还原被认为是一种解毒过程，因为尽管As（Ⅲ）的毒性高于As（Ⅴ），但生物体内存在多种拮抗As（Ⅲ）毒性的过程，包括将砷排出细胞并转化为有机砷。

鱼体内砷的生物转化和分布可能受到组织代谢作用以及组织之间砷摄取/排除关系的影响。肝脏被认为是负责砷生物转化的最重要器官。这可能是这一过程首先发生的部位，然后砷物种才会被转运到其他组织或经胆汁排出。在所有组织中，肝脏中甲基化砷（MMA和DMA）的比例最高。与MMA相比，DMA占总砷的比例更高，这表明DMA在组织中是一种更稳定的形式。在描述性分析中，使用As（Ⅲ）进行测定时，肝脏中AsB的比例最高。比较在相同暴露时间、使用不同浓度（5和10mg/L）下获得的结果，显示出剂量反应效应的规律，当暴露浓度加倍时，AsB值增加了2倍。这些结果表明，AsB可能是As生物转化的终产物，能够在体内积累，而不是被排出体外。甲基化后，机体对As解毒有不同的策略。在本研究中，在5和10mg/L浓度下暴露于As（Ⅲ）和As（Ⅴ）1天和7天后，AsB是在所有组织中以及所有实验条件下的主要砷形态，其比例范围为13%至80%，表明尼罗罗非鱼能够将MMA和DMA转化为AsB，而AsB是反应性和毒性最低的砷形态之一。AsB的合成机制尚未完全理解，目前其形成的模型主要基于潜在的生物合成前体和中间产物的检测。如Zhang等报道，AsB合成存在几种可能的途径。主要假设是二甲基/三甲基砷糖的降解，然后通过甲基化和氧化形成AsB。其他已经描述的途径包括AsC的氧化生成AsB以及DMA的甲基化。有报道称，微生物和低营养级的生物参与了AsB的形成，而在高营养级生物中检测到的AsB主要是由于沿食物链的营养积累。有研究表明肠道微生物群与AsB的积累存在相关性。Foster和Maher提出，草食动物肠道中的细菌可以通过尚未明确的路径合成AsB。Zhang等证明，海洋淡水稻鱼中AsB的合成是由肠道微生物群介导的，并且这有助于砷的高生物累积。Song等报道，肠道微生物群促进了罗非鱼中砷的生物积累和生物转化，并能将As（Ⅴ）转化为有机砷化合物。

从统计学上看，罗非鱼暴露于无机As（Ⅲ）后获得的AsB值在所有组织中呈现相同的模式，肌肉除外（图5d），最低和最高的AsB水平分别出现在暴露1天的5mg/L和暴露7天的10mg/L（图5a–c）。在肌肉中，最高浓度出现在暴露7天的5mg/L暴露，尽管这在统计学上不显著。值得注意的是，肝脏表现出最高水平的AsB生物转化（图5b），这在描述性分析中也有显示，这些水平在10mg/L的As（Ⅲ）下最高。

图5.在尼罗罗非鱼暴露于As（III）后，不同组织中的AsB质量分数。AsB：甜菜碱砷。

然而，考虑到罗非鱼在暴露于无机As（Ⅴ）后的AsB值，只有鳃组织（图6c）呈现出上述模式。在其他组织中，对于肝脏和肌肉（图6b和d），暴露于5mg/L导致最低（暴露1天）和最高（暴露7天）值，尽管只有肝脏在这些实验条件下显示出显著增加（约10倍）。与其他在暴露7天时呈现最高生物转化率的组织不同，胃（图6a）在暴露于10mg/L时在暴露1天时呈现最高水平。在实验条件下，罗非鱼暴露于无机As，因此在组织中检测到的AsB是由于无机As通过甲基化生物转化后进一步转化为AsB。在本实验中，描述性分析表明，在整个暴露期间，AsB比例在As（Ⅲ）处理组中高于As（Ⅴ）处理组。Thomas等人表明，砷的代谢涉及一系列的还原和氧化反应，其中As（Ⅴ）被还原为As（Ⅲ），而氧化甲基化生成甲基化的三价和五价代谢产物。然而，除了作为一种解毒机制之外，有人提出甲基化可能激活砷的毒性和致癌潜力。在该途径中形成的中间产物和最终产物可能比无机砷更具反应性和毒性，能够影响基因转录，并作为比未甲基化种更强效的细胞毒性酶抑制剂。DMA和AsB物种是该过程的最终产物，这些物种的含量增加表明代谢过程的进展。相比之下，MMA和无机砷的中间代谢物的积累则表明代谢速率较低，从而影响As的分布和排泄。

图6.不同组织中尼罗罗非鱼暴露于As（V）后的AsB质量分数。

（4）砷与硒的拮抗作用

开展As（Ⅲ）和Se（Ⅳ）的拮抗试验前，需先进行硒的急性毒性试验，测定半致死浓度（使半数试验群体死亡的致死剂量浓度）。本研究测得硒的半致死浓度为2.49mg/L，因此拮抗试验中选用1mg/L的Se（Ⅳ），该浓度不会导致尼罗罗非鱼在试验期间死亡。目前关于硒对鱼类（包括尼罗罗非鱼）急性毒性的研究较少，多数研究通过硒补充试验，探究硒对鱼类暴露于污染物时的保护作用。Ranzani-Paiva等研究了Se（Ⅳ）对尼罗罗非鱼幼鱼的96小时半致死浓度，结果为4.42mg/L。

表5和表6分别为拮抗试验后，尼罗罗非鱼不同组织中的总砷和硒浓度。As（Ⅲ）和Se（Ⅳ）联合暴露后，尼罗罗非鱼肝脏、胃、鳃、肌肉的砷累积浓度范围分别为0.02~5.55μg/g、0.10~11.7μg/g、0.11~3.43μg/g、0.05~3.03μg/g；硒累积浓度范围分别为0.02~4.22μg/g、0.11~7.39μg/g、0.06~3.70μg/g、0.02~1.57μg/g。

表5.不同组织中尼罗罗非鱼暴露于As（III）和Se（IV）后总As浓度。

表6.不同组织中尼罗罗非鱼暴露于As（III）和Se（IV）后总Se浓度。

试验开始时，采集少量水样，采用ICP-MS测定砷和硒浓度，结果显示，砷的平均浓度为5.20±0.07mg/L和10.1±0.03mg/L，硒的平均浓度为1.11±0.15mg/L。对照组水体中的砷和硒浓度均低于ICP-MS的定量限。

对比As（Ⅲ）受控暴露试验（表3）和As（Ⅲ）和Se（Ⅳ）拮抗试验的结果可见，不同浓度和不同暴露时间下，所有试验组织的砷浓度均显著降低。其中，作为砷主要代谢器官的肝脏，在10mg/L As（Ⅲ）暴露1天和7天的条件下，砷浓度分别降低6倍和4倍，表明硒对砷的毒性具有保护作用。

已有文献报道，硒对水环境中的多种污染物均具有保护作用。Atencio等探究了膳食补充Se（Ⅳ）对尼罗罗非鱼暴露于含微囊藻毒素的蓝细菌细胞所致毒性的影响，结果表明硒具有保护作用，高剂量硒可改善蓝细菌感染导致的鱼体肝脏、肾脏、心脏和胃肠道的组织病变。Cabezas-Sanchez等评估了施用Se（Ⅳ）对斑马鱼甲基汞生物累积和毒性的保护作用，发现Se（Ⅳ）可显著降低甲基汞的生物累积系数和氧化应激，其机制为联合施用Se（Ⅳ）可激活斑马鱼的多种防御机制。

尽管砷和硒的化学性质和代谢途径相似，但二者存在相互毒性拮抗作用。砷抑制细胞呼吸，诱导活性氧（ROS）生成，进而引发氧化应激。硒具有重要的生理和生态毒理学意义，是大多数生物体必需的微量元素，但不同化学形态的硒在高浓度下具有毒性，可通过与巯基反应增加活性氧的生成。硒参与调节多种生物和生化功能，如保护细胞膜免受氧化损伤，同时也是谷胱甘肽过氧化物酶等具有抗氧化功能的硒蛋白活性位点的组成成分，谷胱甘肽过氧化物酶可降低细胞内的ROS水平。

目前已有多种关于硒与砷相互作用机制的假说，二者相互解毒的直接机制为形成砷-谷胱甘肽复合物。Se（Ⅳ）被快速吸收并转化为氢硒化物，在As（Ⅲ）和GSH存在的条件下，生成硒代双-S-谷胱甘肽基砷离子。研究通过X射线光谱证实，同时处理As（Ⅲ）和Se（Ⅳ）的实验动物胆汁中存在该复合物，为二者的拮抗相互作用提供了分子基础。