期刊名称：Plant physiology and biochemistry 

影响因子：5.7

DOI：https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2023.108026

该研究以莴苣为试验材料，探究了0.1mg mL^-1水杨酸（SA）及β-环糊精包封水杨酸（e-SA）对100mg・L^-1芴（FLN，低分子量多环芳烃）污染下莴苣生长、光合特性及抗氧化系统的调控效应，旨在明确包封水杨酸在缓解多环芳烃胁迫中的优势及作用机制。研究通过水培试验设置对照、FLN胁迫、FLN+SA、FLN+e-SA等处理，测定了莴苣生长参数、气体交换、叶绿素荧光、氧化胁迫标志物及抗氧化系统相关指标。结果显示，FLN污染显著抑制莴苣生长，使其相对生长速率下降27%、叶片含水量降低14%，同时引发气孔限制，导致碳同化、光合效率显著降低，还诱导活性氧大量积累，使脂质过氧化水平升高40%。SA和e-SA处理均能缓解FLN胁迫危害，二者作用机制存在差异：直接施用水SA可使莴苣组织积累高含量SA，有效缓解胁迫引发的生理限制，通过刺激脯氨酸积累、缓解气孔限制调控水分关系，部分激活AsA-GSH循环并提高抗氧化酶活性，减少氧化损伤；e-SA处理仅使组织积累中等含量SA，调控效果更优，可使莴苣相对生长速率恢复27%、含水量提升24%，还能通过3倍提高SOD活性、80%提高CAT活性，更高效地清除H₂O₂、抑制脂质过氧化，同时更好地调控光合光化学反应，恢复PSII光合效率，促进胁迫下莴苣生长。

研究证实，SA和e-SA均可通过调控水分关系、激活抗氧化防御、保护光合反应缓解FLN胁迫，而e-SA凭借缓慢释放的特性，能避免SA过量积累的副作用，在调控光合与生化反应、减轻氧化损伤、促进胁迫下植物生长方面表现出更优效果，为利用包封水杨酸缓解农作物多环芳烃污染胁迫提供了实验依据。

本研究对莴苣种子进行表面灭菌后，置于湿润滤纸上萌发。一周后，将幼苗转移至1/2霍格兰营养液中，在人工控制条件下培养，21天的生长周期内每两天更换一次水培基质。向霍格兰营养液中添加100mg・L^-1的芴（FLN），对莴苣幼苗进行胁迫处理。根据文献报道确定0.1mg・mL⁻¹（即0.72mM）为莴苣幼苗的有效水杨酸处理浓度，因此本研究将水杨酸浓度调整为该值。将0.1g β-环糊精溶于蒸馏水，加入0.01g溶解的水杨酸，定容至100mL，将该包封水杨酸溶液置于磁力搅拌器上室温孵育过夜后，用于处理实验组植物。同时配制相同浓度的未包封水杨酸溶液（不添加β-环糊精），采用叶面喷施方式，对相应实验组植物各喷施5mL上述两种溶液。对芴（FLN，100mg・L^-1）胁迫下的莴苣幼苗分别施用水杨酸（SA，0.1mg・mL^-1）和β-环糊精包封水杨酸（e-SA，0.1mg・mL^-1），处理1周后收获植株样品。

（1）芴、水杨酸和包封水杨酸处理对莴苣生理指标和气体交换参数的影响

对照条件下，水杨酸处理使莴苣的相对生长速率（RGR）提高21%，而包封水杨酸处理组与对照组相比无显著变化（图1A）；芴污染导致莴苣相对生长速率下降27%，盐胁迫下施用水杨酸对相对生长速率无显著影响，而芴+包封水杨酸处理组的相对生长速率提高27%。水杨酸处理组莴苣叶片的相对含水量（RWC）与对照组无显著差异（图1B），包封水杨酸处理使相对含水量提高10%；芴胁迫导致莴苣叶片相对含水量下降14%，芴+水杨酸和芴+包封水杨酸处理组的相对含水量分别恢复9%和24%。对照条件下，水杨酸处理使莴苣叶片的脯氨酸（Pro）含量降低，而包封水杨酸处理使其升高（图1C）；芴污染使脯氨酸积累量增加12%，芴+水杨酸和芴+包封水杨酸处理组的脯氨酸含量则分别提高48%和1倍。对照组莴苣叶片的水杨酸（SA）含量为180μg・mL^-1（图1D）；芴胁迫使水杨酸含量略有下降，而芴+水杨酸和芴+包封水杨酸处理则使植物内源水杨酸积累量分别增加77%和55%。

对照和胁迫条件下，水杨酸和包封水杨酸处理均能提高碳同化速率（A）（图2A）；芴胁迫使碳同化速率较对照组下降67%，而芴+水杨酸和芴+包封水杨酸处理则使该指标提升1倍。芴污染导致莴苣气孔导度（g_s）较对照组降低66%（图2B），水杨酸处理在对照和胁迫条件下均能最有效地维持气孔导度。芴处理组的胞间CO₂浓度（C_i）下降35%（图2C），水杨酸处理对胞间CO₂浓度无显著影响，而芴+包封水杨酸处理使该指标提高45%。包封水杨酸单独处理组和芴+水杨酸处理组的羧化效率（A/C_i）最高（图2D）。芴污染使莴苣叶片的蒸腾速率（E）下降约60%（图2E），与胁迫组相比，芴+水杨酸和芴+包封水杨酸处理组的蒸腾速率分别提高1倍和65%。芴处理组的气孔限制值（Ls）升高，芴+水杨酸处理使该指标降低40%（图2F），而芴+包封水杨酸处理仅使其较胁迫组降低13%。

图1.芴（FLN，100mg・L⁻¹）胁迫下，经水杨酸（SA，0.1mg・mL⁻¹）或β-环糊精包封水杨酸（e-SA，0.1mg・mL⁻¹）处理的莴苣叶片中，相对生长速率（RGR，A）、相对含水量（RWC，B）、脯氨酸含量（Pro，C）及水杨酸含量（D）的变化情况。所有实验数据均进行单因素方差分析（ANOVA），p<0.05表示组间差异具有统计学意义。

图2.芴（FLN，100 mg・L⁻¹）胁迫下，经水杨酸（SA，0.1mg・mL⁻¹）或β-环糊精包封水杨酸（e-SA，0.1mg・mL⁻¹）处理的莴苣叶片中，碳同化速率（A，A）、气孔导度（g_s，B）、胞间CO₂浓度（C_i，C）、羧化效率（D）、蒸腾速率（E，E）及气孔限制值（L_s，F）的变化情况。所有实验数据均进行单因素方差分析（ANOVA），p<0.05表示组间差异具有统计学意义。

（2）水杨酸和包封水杨酸处理对芴胁迫下莴苣叶绿素a荧光参数的影响

芴胁迫使莴苣叶片的F_v/F_m值下降17%（图3A），芴+水杨酸和芴+包封水杨酸处理使该指标较胁迫组提高20%，恢复至对照组水平。F_v/F_o值呈现相似的变化趋势，芴胁迫使该指标降低15%（图3B），而上述两种处理使其提高68%，恢复至正常水平。与对照组相比，芴处理组的F_o/F_m值升高20%（图3C），芴+水杨酸和芴+包封水杨酸处理组的该指标则分别降低22%和32%。图4为反映光系统II光化学活性的OJIP快速荧光动力学曲线参数雷达图。结果显示，对照和胁迫条件下，水杨酸和包封水杨酸处理均会使ABS/RC、TR_o/RC、DI_o/RC和dV/dto参数降低；芴胁迫会使V_I和V_J值升高；同时，芴+水杨酸和芴+包封水杨酸处理可诱导总性能指数PI_ABS和PI_total升高。

图3.芴（FLN，100mg・L⁻¹）胁迫下，经水杨酸（SA，0.1mg・mL⁻¹）或β-环糊精包封水杨酸（e-SA，0.1mg・mL⁻¹）处理的莴苣叶片中，光系统II光化学最大量子产额（F_v/F_m，A）、潜在光化学效率（F_v/F_o，B）及光合机构生理状态（F_o/F_m，C）的变化情况。所有实验数据均进行单因素方差分析（ANOVA），p<0.05表示组间差异具有统计学意义。

图4.芴（FLN，100mg・L⁻¹）胁迫下，经水杨酸（SA，0.1mg・mL⁻¹）或β-环糊精包封水杨酸（e-SA，0.1mg・mL⁻¹）处理的莴苣叶片的OJIP快速荧光动力学曲线雷达图。

（3）水杨酸和包封水杨酸处理对芴胁迫下莴苣过氧化氢积累和脂质过氧化水平的影响

采用H₂DCF-DA染色结合激光共聚焦显微镜观察，结果显示芴污染导致保卫细胞的叶绿体中大量积累过氧化氢（图5A）；而芴+水杨酸和芴+包封水杨酸处理组的荧光信号减弱，表明叶绿体中的活性氧积累减少。与之相符的是，芴胁迫使莴苣叶片的过氧化氢含量升高47%（图5B），与胁迫组相比，芴+水杨酸和芴+包封水杨酸处理组的活性氧积累量分别降低10%和17%。芴污染使莴苣叶片的TBARS含量升高40%（图5C），芴+水杨酸处理使该指标降低16%，而芴+包封水杨酸处理使其降低24%，恢复至对照组水平。

图5.芴（FLN，100mg・L⁻¹）胁迫下，经水杨酸（SA，0.1mg・mL⁻¹）或β-环糊精包封水杨酸（e-SA，0.1mg・mL⁻¹）处理的莴苣叶片中，经2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（H₂DCF-DA）染色、激光共聚焦显微镜观察的保卫细胞过氧化氢（H₂O₂）积累情况（A），以及叶片过氧化氢含量（H₂O₂，B）、脂质过氧化水平（硫代巴比妥酸反应物含量，TBARS，C）的变化。所有实验数据均进行单因素方差分析（ANOVA），p<0.05表示组间差异具有统计学意义。

（4）水杨酸和包封水杨酸处理对芴胁迫下莴苣抗氧化酶组分的影响

凝胶电泳结果显示，莴苣叶片中存在4种超氧化物歧化酶（SOD）同工酶（锰型SOD1/2和铁型SOD1/2）（图6A）。对照条件下，水杨酸处理使超氧化物歧化酶活性降低60%，其中锰型SOD2和铁型SOD1同工酶的条带强度变化尤为显著（图6B）；包封水杨酸处理组的酶活性较对照组降低22%。芴胁迫使超氧化物歧化酶活性下降47%，而芴+水杨酸和芴+包封水杨酸处理则分别使该酶活性提高26%和208%。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）分析显示，莴苣中仅存在1种过氧化氢酶（CAT）同工酶（图6C）。芴污染使过氧化氢酶活性提高40%（图6D），胁迫下施用水杨酸可进一步诱导该酶活性，芴+水杨酸和芴+包封水杨酸处理组的过氧化氢酶活性分别提高25%和80%。

凝胶结果显示，过氧化物酶（POX）存在5种同工酶（POX1-5）（图7A）。对照和胁迫条件下，水杨酸和包封水杨酸处理均能提高过氧化物酶活性（图7B）；芴污染使该酶活性较对照组提高2.6倍，芴+水杨酸处理组的过氧化物酶活性最高，较芴胁迫组提高28%。图7C的电泳结果显示，莴苣叶片中存在2种谷胱甘肽S-转移酶（GST）同工酶（GST1-2）。对照条件下，水杨酸和包封水杨酸处理分别使谷胱甘肽S-转移酶活性提高46%和129%（图7D）；芴胁迫也使该酶活性提高21%，芴+水杨酸和芴+包封水杨酸处理组的酶活性则均进一步提高约25%。

凝胶染色结果显示，莴苣中存在3种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）同工酶（NOX1-3）（图8A）。对照条件下，水杨酸和包封水杨酸处理对该酶活性的影响呈相反趋势：水杨酸处理使酶活性降低54%，而包封水杨酸处理使其提高114%（图8B）；芴胁迫使烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶活性降低23%，芴+水杨酸处理对其无显著影响，而芴+包封水杨酸处理使该酶活性提高78%。非变性凝胶电泳分析显示，谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）存在3种同工酶（GPX1-3）（图8C）。对照条件下，水杨酸和包封水杨酸处理均使谷胱甘肽过氧化物酶活性提高30%，芴胁迫则使该酶活性提高70%（图8D）；芴+水杨酸处理使酶活性再提高16%，而芴+包封水杨酸处理则使酶活性降低40%，与预期结果相反。

图6.芴（FLN，100mg・L⁻¹）胁迫下，经水杨酸（SA，0.1mg・mL⁻¹）或β-环糊精包封水杨酸（e-SA，0.1mg・mL⁻¹）处理的莴苣叶片中，各类超氧化物歧化酶同工酶的相对条带强度（SOD，A）、总超氧化物歧化酶活性（B）、过氧化氢酶同工酶（CAT，C）及总过氧化氢酶活性（D）。所有数据均采用单因素方差分析（ANOVA），p<0.05表示差异具有统计学意义。

图7.芴（FLN，100 mg・L⁻¹）胁迫下，经水杨酸（SA，0.1mg・mL⁻¹）或β-环糊精包封水杨酸（e-SA，0.1mg・mL⁻¹）处理的莴苣叶片中，各类过氧化物酶同工酶的相对条带强度（POX，A）、总过氧化物酶活性（B）、谷胱甘肽S-转移酶同工酶（GST，C）及总谷胱甘肽S-转移酶活性（D）。所有数据均采用单因素方差分析（ANOVA），p<0.05表示差异具有统计学意义。

图8.芴（FLN，100 mg・L⁻¹）胁迫下，经水杨酸（SA，0.1mg・mL⁻¹）或β-环糊精包封水杨酸（e-SA，0.1mg・mL⁻¹）处理的莴苣叶片中，各类NADPH氧化酶同工酶的相对条带强度（NOX，A）、总NADPH氧化酶活性（B）、谷胱甘肽过氧化物酶同工酶（GPX，C）及总谷胱甘肽过氧化物酶活性（D）。所有数据均采用单因素方差分析（ANOVA），p<0.05表示差异具有统计学意义。

（5）水杨酸和包封水杨酸处理对芴胁迫下莴苣抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环的影响

莴苣叶片中存在2种抗坏血酸过氧化物酶（APX）同工酶（APX1-2）（图9A）。芴污染使抗坏血酸过氧化物酶活性提高2.1倍（图9B），芴+水杨酸处理使该酶活性再提高14%；对照条件下，包封水杨酸处理使酶活性提高33%，但芴+包封水杨酸处理对其无显著影响。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，谷胱甘肽还原酶（GR）存在2种同工酶（GR1-2）（图9C）。仅在对照条件下，包封水杨酸处理使谷胱甘肽还原酶活性提高33%（图9D）；芴胁迫使该酶活性降低62%，而芴+水杨酸和芴+包封水杨酸处理对其均无显著的统计学影响。

芴胁迫下，莴苣的单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性无显著变化，而脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）活性降低40%（图10A、B）。与胁迫组相比，芴+水杨酸处理使单脱氢抗坏血酸还原酶活性提高67%、脱氢抗坏血酸还原酶活性提高26%；芴+包封水杨酸处理使单脱氢抗坏血酸还原酶活性提高24%，但对脱氢抗坏血酸还原酶活性无显著影响。仅芴+水杨酸处理使莴苣叶片的总抗坏血酸（tAsA）含量提高25%（图10C）；除芴+包封水杨酸处理组的氧化型抗坏血酸（DHA）含量升高30%外，其余各处理组的该指标均呈下降趋势（图10D）。芴污染使莴苣的谷胱甘肽（GSH）含量较对照组降低42%（图10E），而芴+水杨酸处理使谷胱甘肽库含量提高1倍。同理，芴胁迫使氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量降低19%，而芴+水杨酸处理使其提高2.5倍（图10F）。除芴+包封水杨酸处理组的抗坏血酸/氧化型抗坏血酸（AsA/DHA）比值降低24%外，其余各处理组的该比值均较对照组升高（图10G）；仅芴+水杨酸和芴+包封水杨酸处理组的谷胱甘肽氧化还原状态降低（图10H）。

图9.芴（FLN，100mg・L⁻¹）胁迫下，经水杨酸（SA，0.1mg・mL⁻¹）或β-环糊精包封水杨酸（e-SA，0.1mg・mL⁻¹）处理的莴苣叶片中，各类抗坏血酸过氧化物酶同工酶的相对条带强度（APX，A）、总抗坏血酸过氧化物酶活性（B）、谷胱甘肽还原酶同工酶（GR，C）及总谷胱甘肽还原酶活性（D）。所有数据均采用单因素方差分析（ANOVA），p<0.05表示差异具有统计学意义。

图10.芴（FLN，100mg・L⁻¹）胁迫下，经水杨酸（SA，0.1mg・mL⁻¹）或β-环糊精包封水杨酸（e-SA，0.1mg・mL⁻¹）处理的莴苣叶片中，单脱氢抗坏血酸还原酶活性（MDHAR，A）、脱氢抗坏血酸还原酶活性（DHAR，B）、总抗坏血酸含量（AsA，C）、脱氢抗坏血酸含量（DHA，D）、谷胱甘肽含量（GSH，E）、氧化型谷胱甘肽含量（GSSG，F）、抗坏血酸/脱氢抗坏血酸比值（AsA/DHA，G）及谷胱甘肽氧化还原状态（GSH redox state，H）。所有数据均采用单因素方差分析（ANOVA），p<0.05表示差异具有统计学意义。