期刊名称：Nature Communications
影响因子：16.6
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-025-56226-w
本研究以九个杨树物种（分属Leuce、Aigeiros、Tacamahaca、Turanga四个组）为对象，结合根系转录组、代谢组及根际微生物组的多组学数据，构建基因-黄酮-微生物共表达网络，系统揭示了杨树通过根部分泌黄酮类物质（尤其是tricin和apigenin）招募有益假单胞菌（Pseudomonas）的分子机制。研究发现，生长旺盛的Leuce组杨树高表达PopGL3基因，促进tricin分泌，从而富集根际假单胞菌；这些假单胞菌通过生物固氮、分泌IAA等方式，增强杨树在低氮条件下的氮吸收能力与次生根发育，进而促进植株整体生长。该研究阐明了植物-代谢物-微生物三者互作的调控模式对杨树适应性具有重要作用，全面解析了三芹素的关键调控机制，并深入阐明了植物关键代谢物与其转录组及根际微生物之间的相互作用机制。
本研究以九个杨树物种（Pto-M、84K、Pal-Y、LM50、107、H3-1、Pot-M、Psz-Z、Peu-H）为材料，种植于低氮（总氮0.089%）未灭菌的自然混合土壤中，生长3个月后采集根系与根际土壤样本。每物种设3个生物学重复（Peu-H因根系样品不足，将2株合并为1个重复）。数据处理中，采用k-means聚类将差异黄酮分为6类，进一步通过Pearson相关筛选与黄酮显著相关的差异表达基因和ASV，构建基因-黄酮-微生物共表达网络。同时采用LEfSe识别各组间差异菌群，使用Mantel检验分析黄酮模块与微生物家族的相关性。对关键基因PopGL3和PopCHS4进行过表达转基因杨树构建，结合DAP-seq、qRT-PCR、RFP标记假单胞菌定殖实验、共聚焦显微镜及CFU计数，验证其调控tricin分泌及假单胞菌招募功能。
（1）土壤微生物群落对杨树的促生效应
为探究根系微生物组对植株生长适应性的作用，本研究选取4个杨树种组（Leuce、Aigeiros、Tacamahaca、Turanga）共9种代表性杨树，采用低氮未灭菌天然混合土壤（全氮含量0.089%）开展盆栽试验。培养3个月后，测定杨树株高、地径、地上生物量、地下生物量、根长、叶长、叶宽、叶面积、叶片数、叶绿素含量及叶片氮含量共11项生长表型指标。结果显示，白杨组杨树苗生物量最优，其次为黑杨组与青杨组，胡杨组生物量最低（方差分析，P<0.01）。不同杨树品种生长指标差异显著：根系生物量均值为0.56~15.76g，株高27.02~129.91cm，叶面积1.06~76.30cm²。其中速生品种P.tomentosa Lumao 50（LM50）地上生物量为慢生品种P.euphratica H（Peu-H）的14.02倍。
为明确基因型介导的土壤微生物群落是否造成杨树生长差异，选取长势优异的LM50与长势孱弱的Peu-H开展土壤互移试验。将Peu-H移栽至LM50种植过的土壤中，其地上生物量较种植于自身原土显著提升27.22%（图1A、B）；反之，LM50移栽至Peu-H原土后，地上生物量较自身原土显著下降19.58%（P<0.01；图1A、B）。灭菌土壤中，LM50地上生物量较Peu-H高出7.37g；该差值在Peu-H原土中扩大至8.29g，在LM50原土中进一步增至10.26g（图1A、B）。土壤养分检测结果表明，LM50与Peu-H种植后的非根际土、根际土养分含量无显著差异；且不同基因型根系分泌物对灭菌土壤中84K杨、Peu-H生物量无明显影响。综上，植物共生微生物群落可显著促进杨树生长，且促生效果存在基因型依赖性：优良基因型塑造的土壤微生物群落促生能力更强，弱势基因型富集的土壤微生物群落促生作用则相对微弱。
图1.杨树根际富集的特异性微生物类群与植株生长性状存在关联。A.不同土壤（LM50原土、Peu-H原土）中移栽种植的LM50与Peu-H植株形态差异。B.不同土壤中移栽后LM50和Peu-H的株高及地上部鲜生物量。C.采用线性判别分析效应量法（LEfSe）筛选不同杨树种组间差异富集的根际细菌；圈层由内至外依次为界、门、纲、目、科、属水平。节点代表物种，节点越大表明物种相对丰度越高；字母对应不同菌门，颜色代表该物种在对应树种组中差异显著。基于9种杨树的微生物群落（D、G，ASV＞2）、生长表型（E、H）及转录组（F，I，TPM＞0）数据集，分别开展主成分分析（PCA，单因素置换多元方差分析计算P值）与层次聚类分析（HCA）。不同字母代表组间差异显著（单因素方差分析，P＜0.05）。FW：鲜重；比例尺：A图为10cm。
（2）不同基因型杨树根际微生物群落的物种组成特征
为探究杨树基因型对微生物群落组成及功能潜力的影响，本研究采集非根际土与根际土样品。利用16S rRNA基因V3-V4区，通过Illumina MiSeq测序技术，分析9种杨树两类土壤样本的细菌群落结构，物种注释层级涵盖界、门、纲、目、科、属。种组水平分析结果显示，胡杨组根际微生物香农多样性指数最高，黑杨组、青杨组、白杨组依次递减，而非根际土微生物多样性组间无显著差异。
4个杨树种组根际微生物群落结构差异，由22个细菌门的相对丰度显著变化主导（图1C）。属水平上，胡杨组、黑杨组、青杨组、白杨组分别鉴定出109、90、45、37个特异性差异标志菌群（图1C）。其中，胡杨组内亚硝化螺菌属（相对丰度1.07%）、马杜拉放线菌属（0.03%）、土芽孢杆菌属（0.23%）富集程度较高；黑杨组显著富集芽孢杆菌属（1.61%）与肠杆菌属（2.80%）；白杨组37个差异标志属总相对丰度达41.15%，以假单胞菌属丰度最高，占比13.77%。综上表明，杨树基因型可通过定向筛选特定微生物类群，进而构建专属的根系定植细菌群落。
（3）基因表达、黄酮类物质合成与根际微生物群落的共表达网络
为探究杨树基因表达与根际微生物定植的关联，本研究以种植于低氮未灭菌天然混合土壤的9种杨树为材料，测定根系转录组数据，总测序数据量达73.7Gb，共鉴定得到38739个表达基因（TPM＞0）。基于微生物群落（图1D、G）、生长表型（图1E、H）及转录组（图1F、I）数据开展PCA与HCA分析，可将9种杨树清晰划分为4个类群，分别对应四大杨树种组，证实基因型显著调控杨树微生物群落组成、生长性状与基因表达模式。差异基因功能富集分析结果显示，4个种组间差异表达基因，显著富集于黄酮代谢通路。黄酮类物质在植物根系微生物群落构建中发挥关键作用，拟南芥、玉米中均已证实该调控机制。据此推测，杨树功能基因可调控黄酮合成，进而改变根际微生物群落组成与多样性。
进一步对9种杨树根系样本进行定量检测，共鉴定出129种黄酮类化合物，其中110种（占比85.27%）在至少两个树种间存在积累量差异。采用K均值聚类算法，依据积累模式将差异黄酮分为6个聚类簇；再通过皮尔逊相关性分析，严格筛选与各聚类簇黄酮显著关联的DEGs及ASV（图2）。整体分析共筛选出17698个DEGs与2579个ASV可与至少一种黄酮物质形成共表达关系。各聚类簇内基因、黄酮及微生物丰度特征具有明显种组特异性，分别对应胡杨组（聚类I）、白杨组（聚类IV）、黑杨组（聚类V），表明基因表达模式、黄酮积累特征与根际微生物富集规律均存在显著种组特异性。
为利用共表达网络解析杨树基因-黄酮-微生物调控通路，本研究筛选得到147个酶编码基因，其编码蛋白可催化黄酮生物合成通路中12步酶促反应，涵盖苯丙氨酸代谢、苯丙烷生物合成及黄酮生物合成途径。13个查尔酮合酶基因中有4个、全部3个黄酮类3'-羟化酶（F3′H）基因均富集于聚类IV；F3′H可催化柚皮素生成圣草酚、二氢山奈酚生成二氢槲皮素，二者是黄酮与黄烷醇合成的重要前体物质，聚类IV中也鉴定出11种黄酮类物质。同时聚类IV还鉴定出26个bHLH转录因子与38个MYB转录因子，两类转录因子可协同调控黄酮合成。聚类V中2个黄酮醇合酶（FLS）基因与7种黄酮醇物质存在强相关性。综上，该共表达网络富集大量黄酮合成相关基因，可为阐明杨树微生物定植的遗传机制、挖掘候选功能基因提供理论依据。
图2.各聚类簇中27份样本转录组、代谢组与微生物ASV的共表达网络。采用K均值聚类算法结合双侧皮尔逊相关性分析（r≥0.7，P<0.01），将杨树基因表达谱（红色）、黄酮代谢组表达谱（蓝色）及微生物群落ASV（橙色）划分为6个聚类簇。横轴代表9种杨树共计27份试验样本，纵轴为基因、黄酮物质及ASV经Z得分标准化后的数值，粗实线代表均值。方框内数值为各聚类簇所含基因、黄酮及ASV数量，如聚类I包含3672个基因、11种黄酮、865个ASV。横轴样本编号对应分组：白杨组（1–3：Pto-M；4–6：84K；7–9：Pal-Y；10–12：LM50）；黑杨组（13–15：H3-1；16–18：107）；青杨组（19–21：Pot-M；22–24：Psz-Z）；胡杨组（25–27：Peu-H）。聚类I基因在胡杨组中特异性高表达；聚类IV基因在白杨组中显著上调（筛选标准同上）。（4）根际微生物组成与杨树基因表达、黄酮积累及生长性状协同一致为进一步完善调控网络，本研究聚焦生长表型差异最显著的胡杨组与白杨组，选取分别在两类树种中优势表达的聚类I、聚类IV开展深入分析。功能富集结果显示，富集于胡杨组的聚类I基因，主要参与遗传信息加工、核糖体合成、错配修复等基础持家代谢过程。富集于白杨组的聚类IV基因则显著富集于物质能量循环通路，包括光合固碳、氮代谢、能量代谢，以及苯丙氨酸代谢、苯丙烷合成、黄酮合成等黄酮代谢通路，因此后续重点解析聚类IV。聚类IV内微生物ASV以变形菌门、拟杆菌门为主，占比分别为54.04%、18.71%；菌群数量排名靠前的科为假单胞菌科、噬几丁质菌科、黄单胞菌科、伯克霍尔德菌科，上述类群在白杨组根际显著富集。代谢层面，白杨组根系中黄酮类物质、麦黄酮、芹菜素及其衍生物积累量最高（图3A）。已有研究证实，芹菜素可招募根瘤菌、草酸杆菌科、假单胞菌属等有益菌群，提升植株氮素吸收能力；麦黄酮与芹菜素结构相近，且二者同属KEGG ko00944通路，提示其具备相似生物学功能（图3B）。
为明确杨树根际微生物群落结构与转录组特征、黄酮代谢及生长表型的内在关联，本研究构建基因-黄酮-微生物-生长性状亚调控网络。结果表明，黄酮合成通路基因表达量与黄酮类物质积累量呈极显著正相关（图3C）；黄酮类物质富集特征与假单胞菌科、伯克霍尔德菌科、纤维弧菌科、黄单胞菌科 ASV 丰度显著关联，其中假单胞菌科ASV数量最多，共计58个，均归属于假单胞菌属。假单胞菌科与黄酮代谢模块、黄酮合成基因模块相关性排名靠前（图3D）；该菌群在非根际土中丰度仅0.86%，在白杨组根际富集至13.78%，为白杨组特异性富集菌群，且与杨树生长指标显著相关（图3E）。属水平下，兼具固氮、解磷、分泌促生激素及抑菌功能的假单胞菌属，与植株生长性状呈极强相关性（图3F）。综上，白杨组自身遗传特性可定向富集特定根际有益微生物类群，该菌群与植株基因表达模式、黄酮物质积累及生长发育性状高度协同耦合。
图3.基因表达、黄酮积累与杨树根际微生物组成及生长性状的关联。A.不同杨树种组根系中芹菜素、麦黄酮及其衍生物含量热图，27份样本以不同颜色区分，各色对应单一树种组；星号标注白杨组显著富集的黄酮类物质。B.芹菜素与麦黄酮化学结构式。C.聚类IV内黄酮合成相关基因、黄酮类物质与ASV的相关性网络，红色代表网络中鉴定到的基因，筛选标准为双侧皮尔逊分析、r≥0.7、P＜0.01。D.排名前20的微生物科类与聚类IV黄酮模块、基因模块的相关性网络。其中基因模块为聚类IV经KEGG富集得到的通路：00910氮代谢、00710卡尔文循环固碳、00400苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸合成、00360苯丙氨酸代谢、00940苯丙烷生物合成、00941黄酮生物合成；黄酮模块包含聚类IV内芹菜素及其衍生物、麦黄酮及其衍生物。节点大小代表所含组分数量，实线表示正相关，线条粗细代表相关程度强弱。E.假单胞菌科丰度与杨树地上、地下生物量的双侧皮尔逊相关性分析，拟合曲线灰色区域为95%置信区间。F.优势菌属与杨树11项生长指标的双侧皮尔逊相关性热图，色块颜色代表相关系数大小。（5）麦黄酮与芹菜素介导假单胞菌提升杨树氮素利用能力并促进侧根发育本研究从白杨组杨树（Pto-M、84K、Pal-Y、LM50）根际土壤中分离获得11株假单胞菌，其中10株菌株的16S rRNA基因序列与聚类IV内ASV同源性高于99%。功能测定结果显示，7株菌株具备固氮能力且携带固氮基因nifH，8株菌株可分泌吲哚乙酸（IAA）。假单胞菌等具鞭毛微生物可依靠集群运动向植物根系定向迁移，该过程直接决定根系定殖效率。在5μM麦黄酮、100μM芹菜素处理条件下，Pto1、Pto5、Pto10菌株集群运动能力显著增强（图4A）。实时荧光定量PCR结果证实，黄酮类物质可诱导鞭毛合成相关基因motA、fliG、bifA与生物膜形成相关基因algU显著上调表达，是菌株成功定殖根系的关键（图4B）。
为明确假单胞菌对杨树生长适应性的促生作用，本研究分别接种单一菌株并构建合成菌群（SynComs：Pto1、Pto5、Pto10）。采用15N同位素标记法示踪杨树土壤源氮素吸收量，微生物大气固氮氮素无同位素标记。菌株接种可显著提升84K杨地上生物量（增幅26.04%~48.03%）、地下生物量（增幅57.51%~81.46%）及叶片氮含量（增幅7.98%~10.15%）（图4C、D），该促生效应在其他树种中同样成立。接种处理组杨树叶片15N丰度显著下降，证实假单胞菌可通过生物固氮（BNF）促进杨树氮素吸收利用。在低氮无菌均质培养体系中，接种Pto1可使杨树侧根（SRs）数量提升9.92倍、侧根总长提升2.88倍（P＜0.01；图4E、F）；而在高氮充足氮素环境下，该菌株对杨树生长及侧根发生的促生效应明显减弱（图4F）。上述结果表明，假单胞菌的促生功能依赖植株低氮胁迫信号通路与植物生理响应间的协同互作。
图4.黄酮介导假单胞菌促进杨树氮素吸收与侧根生长。A.在含5μM麦黄酮或100μM芹菜素的 0.3% 琼脂培养基上，假单胞菌菌株Pto1、Pto5、Pto10的集群运动能力。B.qRT-PCR检测结果表明，麦黄酮与芹菜素可诱导假单胞菌Pto1中鞭毛相关基因motA、fliG、flhA、bifA及生物膜形成相关基因algU、rmlD上调表达，以二甲基亚砜处理菌株为阴性对照，试验设3组生物学重复。 C.低氮土壤条件下接种假单胞菌开展84K杨盆栽试验。D.低氮土壤中接种假单胞菌后84K杨地上干生物量、根系鲜生物量、株高及叶片氮含量测定结果，设3组生物学重复。E.低氮无菌培养基中接种Pto1后84K杨生长表型差异，依次为整株、根系、叶片。F.低氮、高氮无菌培养基中接种Pto1后84K杨侧根数量、侧根长度及植株总鲜重，设3组生物学重复；以10mmol/L硫酸镁溶液为阴性对照，采用双侧独立样本t检验分析。H.在添加Pto1、IAA、TIBA、Pto1+TIBA 及空白处理的1/2MS琼脂培养基上，野生型拟南芥（WT）、plt3plt5plt7与wox11wox12突变体幼苗生长表型。I.空白处理、外源IAA、TIBA、Pto1+TIBA及单独接种Pto1条件下，WT、plt3plt5plt7、wox11wox12拟南芥幼苗侧根数量与主根长度统计，每组 5 个生物学重复。不同字母代表组间差异显著。
（6）Pto1菌株通过分泌IAA激活拟南芥中PLT3PLT5PLT7-介导的侧根发育通路
双子叶植物根系结构复杂，包含侧根（LRs）、不定侧根（adLRs）等多种侧生根系，各类根系由不同遗传通路调控。为明确接种Pto1后诱导形成的侧生根类型，本研究选用两类拟南芥突变体开展试验：plt3plt5plt7三突株系侧根发生受阻，wox11wox12双突株系不定侧根与不定根（AR）发育存在缺陷。接种Pto1培养7天后，plt3plt5plt7突变体无明显侧根生成；而wox11wox12突变体侧根数量显著增多，增幅与野生型（WT）接种处理组基本一致。培养基外源施加IAA后，拟南芥根系发育表型与接种Pto1效果高度相似；而生长素抑制剂TIBA可显著抑制所有供试拟南芥株系的侧根生长，该抑制作用不受Pto1接种影响。综上表明，Pto1分泌的IAA是激活拟南芥PLT3PLT5PLT7介导侧根发育通路的核心调控因子。
（7）PopGL3调控麦黄酮合成进而招募假单胞菌
黄酮类物质在微生物招募过程中作用关键，本研究通过共表达网络筛选黄酮合成相关调控因子。在富集芹菜素与麦黄酮的聚类IV中，鉴定得到bHLH家族转录因子bHLH1（即GL3），该基因在白杨组中显著高表达，且与黄酮类物质及黄酮合成相关基因呈强共表达模式。DNA亲和纯化测序结果证实，PopGL3可调控黄酮合成通路基因PopPA2、PopF3′H、PopDAHP、PopCCR1、PopTHB的转录水平（图5A-C）。过表达PopGL3或PopCHS4可显著激活PopF3′H与黄酮合酶基因PopFNS的表达，使PopCHS4-OE、PopGL3-OE株系根际麦黄酮分泌量显著上升（图5E、F）；其中查尔酮合酶是黄酮分支合成通路首个关键限速酶。
采用15N同位素稀释法测定不同杨树基因型中BNF对植株氮营养的贡献。试验植株种植于低氮未灭菌天然混合土壤，并施加少量15N标记硝酸铵，培养两个月后发现，PopGL3-OE与PopCHS4-OE植株生物量及叶片氮积累量显著提升（图5D、G）；相较于野生型，转基因株系根际微生物固氮对植株氮营养的贡献率显著升高。而灭菌土壤中各基因型植株长势均偏弱，生物量无显著差异。利用扩增子测序解析不同基因型植株固氮能力差异的内在原因，结果表明PopGL3-OE与PopCHS4-OE可重塑根际微生物群落结构，显著富集假单胞菌属菌群（图5H、I）。试验证实，转基因植株根际假单胞菌丰度上调，部分原因是其余多数细菌类群丰度降低，同时也不排除植株通过麦黄酮合成通路对假单胞菌进行定向正向筛选。
为验证转基因植株根系假单胞菌定殖能力增强，利用RFP标记Pto1菌株，借助激光共聚焦显微镜观察不同基因型杨树根系菌株定殖情况。显微观测结果显示，PopGL3-OE与PopCHS4-OE根系内菌株定殖量与荧光密度均显著更高（图6A、B），菌落形成单位计数结果也进一步佐证该结论（图6C）。综上，黄酮合成调控因子PopGL3可通过调控植株分泌麦黄酮招募假单胞菌，进而促进杨树生长与氮素吸收。室内可控无菌体系试验表明，PopGL3-OE植株根际假单胞菌丰度提升伴随菌株根系定殖能力增强，该互作模式可显著提升杨树生长适应性。
图5.PopGL3调控麦黄酮合成进而招募假单胞菌。A.PopGL3的DAP试验结果KEGG富集分析，采用单侧费希尔精确检验，未进行P值校正。B.基于PopGL3的DAP试验结果构建黄酮合成相关基因互作网络，基因间相关性采用双侧皮尔逊系数计算；实线代表正相关，线条粗细表示相关强度。星号标注基因为两次DAP重复试验共同筛选所得，其余基因仅单次试验检出。C.杨树黄酮生物合成及其调控通路示意图，红色字体基因为经至少一次DAP试验证实受PopGL3调控的基因。D.野生型、PopCHS4-OE、PopGL3-OE杨树株系分别在灭菌与未灭菌低氮土壤中的生长表型差异。E.未灭菌低氮土壤中，各株系目标基因相对表达量；F.各株系根系组织内部及根系分泌物中黄酮类物质含量，均设置3组生物学重复。G.灭菌与未灭菌低氮土壤中，各株系杨树地上部干生物量与叶片氮含量，设置3组生物学重复。H、I.属水平下PopCHS4-OE、PopGL3-OE与野生型根际微生物群落丰度差异野生型样本 3 个，两种过表达株系样本各6个，均为生物学重复。星号代表组间差异显著，双侧独立样本t检验：**P<0.001、**P<0.01、P<0.05，ns表示无显著差异，具体P值见原始数据文件；不同字母表示单因素方差分析下组间差异显著（P<0.05）。柱状图数值为平均值±SEM。DW为干重，FW为鲜重；D图标尺15cm。
图6.PopGL3招募假单胞菌定殖杨树根系。A.不同基因型杨树根系中RFP标记Pto1菌株的激光共聚焦荧光成像结果。B.不同基因型杨树根系内RFP荧光强度，采用ImageJ软件测定，设5组生物学重复，采用双侧独立样本t检验分析。C.不同基因型杨树根系中Pto1菌株定殖量，以单位根系鲜重CFU进行定量统计，设5组生物学重复，采用双侧独立样本t检验分析。柱状图数值为平均值±SEM，相关原始数据详见原始数据文件。
4.结论
该研究以多类杨树为材料，探究了基因型介导下杨树与根际微生物的互作机制，证实低氮环境中杨树生长差异主要由根际微生物群落决定，而非土壤养分与根系分泌物。不同杨树种组根际微生物组成与多样性差异明显，白杨组可富集大量假单胞菌等有益菌群，植株基因表达、黄酮物质积累与微生物定植特征高度协同。杨树分泌的芹菜素与麦黄酮能够诱导假单胞菌提升运动能力，促进其在根系定殖，这类菌株可分泌生长素并发挥生物固氮作用，通过调控相关通路促进杨树侧根发育，显著提升植株氮素吸收能力与生长势。研究还鉴定出核心转录因子PopGL3，该因子可正向调控黄酮合成通路基因表达，促进麦黄酮合成分泌，进而定向招募假单胞菌，过表达相关基因能够重塑根际菌群结构，进一步增强杨树生长与氮营养利用效率。研究最终阐明了PopGL3调控黄酮代谢进而招募有益微生物助力杨树适应低氮环境的完整调控通路，为杨树抗逆栽培与良种选育提供了理论支撑。
产品介绍 | 黄酮类化合物的检测与应用