英文标题:Diverging cellwall strategies for drought adaptation in two maize inbreds with contrasting lodging resistance期刊名字：Plant,Cell & EnvironmentDOI：https://doi.org/10.1111/pce.14822本研究以B73（抗茎秆倒伏）和EA2024（易茎秆倒伏）两份性状迥异的玉米自交系为试验材料，探究干旱胁迫下二者细胞壁重塑的差异化调控策略，解析玉米抗倒伏与抗旱性状之间的内在关联。表型与生理测定结果表明，抗倒伏自交系B73耐旱性显著弱于易倒伏自交系EA2024，干旱复水后B73无法存活，而EA2024可恢复正常生长。EA2024天然拥有更高纤维素、对香豆酸含量，保水能力更强。细胞壁组分分析显示，干旱促使EA2024木质素含量下降、阿拉伯聚糖与阿拉伯半乳聚糖等亲水多糖积累。B73则维持木质素总量不变，但木质素H单体减少、S单体及S/G比值上升，糖醛酸含量大幅提升，细胞壁重构程度更剧烈。转录组数据分析发现，干旱对B73基因表达的影响范围更广，细胞壁相关基因的表达模式存在明显自交系特异性，尤其木质素合成通路基因分化最为显著，PAL、C4H、CAD等关键基因表达差异直接造成木质素组分改变。研究还通过免疫检测明确了两类玉米果胶、半纤维素的结构变化规律，并筛选出MYB、WRKY、ABI等参与干旱应答的特异性转录因子及其调控网络。综合分析证实，B73为适配抗倒伏性状形成了刚性强、可塑性低的细胞壁结构，进而削弱了干旱适应能力；而EA2024细胞壁可塑性高，更易通过组分重塑抵御干旱。该研究阐明了玉米抗倒伏与抗旱的拮抗关系，为培育兼具抗倒伏、抗旱特性的玉米新品种提供了理论依据与候选基因资源。2.样本处理
本研究分多组样本开展培育与检测。玉米自交系B73、EA2024分环境培育：转录组材料于气候箱培养至三叶，分别干旱7、9、10d。生理与细胞壁样品温室干旱10d。另设25d重度干旱复水试验，各组均混合5株地上组织，2个生物学重复。生理叶片测定鲜重、膨重、干重计算相对含水量，使用光合仪检测气体交换指标。茎秆粉末经甲醇浸提得到细胞壁醇不溶残渣，依次用CDTA、稀碱、浓碱分级提取果胶与半纤维素组分，通过GC、HPLC、免疫斑点检测木质素、多糖、酚类物质，每项3次技术重复。不同干旱时间点植株提取总RNA，构建双端测序文库，数据比对玉米参考基因组；利用DESeq2筛选差异基因，maSigPro分析时序表达，qRT-PCR验证基因，以LUG为内参。最后整合差异细胞壁基因做转录因子富集，借助软件构建基因型特异调控网络，完整配套多维度样本前处理与分子检测流程。
3.研究结果
①B73与EA2024对干旱胁迫的表型响应态
将B73、EA2024玉米幼苗培养至三叶期，停水10d进行干旱处理。宏观表型观察显示：干旱对B73损伤程度远高于EA2024（图1）。处理10d后测定叶片相对含水量（RWC），无论正常供水还是干旱条件，EA2024叶片保水能力均优于B73。
测定气体交换与叶绿素荧光参数评估植株光合性能，正常供水下，两份自交系PSII实际光化学效率（ΦPSII）、电子传递速率（ETR）、CO2同化速率（A）、胞间CO₂浓度（Ci）无显著差异；但EA2024蒸腾速率（E）显著低于B73。干旱后，EA2024胞间CO₂浓度上升，B73无明显变化。停水25d后复水，检验极端干旱后植株恢复能力：B73全部死亡，EA2024复水1周后完全恢复正常生长表型（图1）。
综上，生理表型结果为茎秆抗倒伏自交系B73干旱敏感，茎秆易倒伏自交系EA2024干旱耐受性更强，二者干旱生理响应存在本质差异。
图1.B73和EA2024在干旱下表现出的表型变化。
②干旱对B73、EA2024细胞壁重塑的影响
研究测定干旱处理10d植株茎秆木质素、多糖含量。采用克拉森法测定木质素总量，硫代酸解-气相色谱质谱联用解析木质素单体组分。结果显示，干旱不改变B73木质素总量，但EA2024茎木质素含量下降20%（图2）。反之，干旱不改变EA2024木质素单体组成，B73则出现H单体减少、S单体与S/G比值上升（图2）。两份自交系经硫代酸解释放的H、G、S单体总量均上升，说明干旱会降低木质素聚合程度。
图2.B73和EA2024在对照和干旱条件下的木质素含量和组成。
细胞壁多糖结果为，正常供水下EA2024纤维素含量高于B73。干旱后两份自交系纤维素含量均上升10%（图3）。总半纤维素在两份自交系中含量相近、不受干旱影响；干旱后EA2024细胞壁葡萄糖含量上升60%，B73糖醛酸含量上升60%（图3）。本研究同时定量细胞壁酯键连接羟基肉桂酸（图4），正常供水下EA2024酯化对香豆酸含量高于B73，干旱无显著改变；两份自交系酯化阿魏酸、交联二阿魏酸含量相近，干旱无显著变化。干旱仅小幅但显著提升EA2024阿魏酸/对香豆酸比值（图4）。
图3.在控制和干旱条件下培养的B73和EA2024的细胞壁多糖组成。
图4.B73和EA2024在对照和干旱条件下生长的植物细胞壁羟基肉桂酸组成。
对细胞壁分级提取，区分钙离子桥联果胶（CDTA组分）、弱交联半纤维素（KI组分）、强交联半纤维素（KII组分），探究干旱对多糖分布的影响（图5）。B73遭遇干旱后KII组分总糖（可提取半纤维素）上升，CDTA、KI组分无变化，KII/KI比值升高。EA2024仅CDTA果胶含量小幅下降，半纤维素分配无变化。两份自交系糖醛酸含量、分布对干旱响应存在差异（图5）。正常供水下EA2024交联糖醛酸总量高于B73，但CDTA可溶性糖醛酸含量低于B73（图3、图5）。干旱后EA2024 CDTA组分糖醛酸上升，B73该组分糖醛酸下降；B73糖醛酸最显著变化出现在KI、KII组分，分别上升1.5倍、3.5倍（图5）。
图5.来自B73和EA2024的细胞壁半纤维素组分在正常和干旱条件下的总糖含量。
采用完整免疫斑点检测（IDA）与热图分析表征CDTA、KI、KII组分细胞壁多糖精细结构（图6）。干旱条件下，相较于对照组，B73 KI组分低甲酯化同型半乳糖醛酸（HG，JIM5抗体识别）增多，RG-I阿拉伯聚糖侧链（LM6抗体识别）减少。KII组分RG-I阿拉伯聚糖侧链减少、半乳聚糖侧链（LM5抗体识别）增多。
EA2024细胞壁干旱重塑幅度高于B73。CDTA组分低甲酯化HG含量上升。KI组分低甲酯化HG下降，同时部分甲酯化HG、阿拉伯半乳聚糖蛋白、非岩藻糖基木葡聚糖含量上升。KII组分RG阿拉伯聚糖侧链含量上升。综上，干旱改变两份自交系三类细胞壁组分，但EA2024 KI组分变化最为剧烈。
图6.细胞壁表位免疫检测的热图。
③干旱诱导细胞壁相关基因（CWGs）表达变化
本研究选取停水7、9、10天取样进行RNA双端转录组测序，序列比对至B73参考基因组后采用DESeq2筛选差异基因（log₂|FC|＞1且校正P＜0.05），主成分分析显示94%变异由两因子解释（自交系固有差异PC1占66%，干旱响应差异PC2占28%）。全基因组尺度下干旱分别调控B73的29%和EA2024的21%基因；针对整理的1485个细胞壁相关基因（涵盖纤维素、半纤维素、果胶、膜/细胞壁蛋白、木质素、木栓质、胼胝质、蛋白酶及转录因子编码基因），干旱调控B73中44%、EA2024中31%细胞壁基因，均高于全基因组调控水平。韦恩分析显示下调趋势更显著：B73下调513个（34.5%）、EA2024下调358个（24.1%），其中311个同步下调；上调方面B73为137个（9.2%）、EA2024为106个（7.1%），62个同步上调。另有8个细胞壁基因在两自交系中响应方向完全相反，包括B73上调而EA2024下调的C4Hb（肉桂酸4-羟化酶）与蔗糖合成酶，以及B73下调而EA2024上调的3个过氧化物酶（参与木质素合成/活性氧生成）、1个果胶降解多聚半乳糖醛酸酶、1个糖基转移酶14及1个金属内蛋白酶。
图7.在全基因组和细胞壁基因目录中，干旱10天后基因表达变化的百分比及细胞壁基因的维恩图分布。
本研究将细胞壁基因（CWGs）分为纤维素/半纤维素生物合成、果胶生物合成、膜结合与细胞壁蛋白（MB/CWP）、木质素生物合成及木栓质/胼胝质沉积五类，每类约50%基因受干旱影响，其中木质素类比例最高（55%）。按自交系影响模式可分为两类：C/HC和木质素类中仅单自交系受影响基因占多数，如C/HC类别中仅B73受影响的90个基因超过两系共有的83个基因，木质素类64个仅B73受影响/30个仅EA2024受影响也呈现类似模式（图8，9）。而果胶、MB/CWP等其他类别的DEGs主要在两系中共现。具体来看，纤维素生物合成中大多数纤维素合酶A（CesA）基因在两系中均被下调，仅B73的CesA2被上调；半纤维素方面糖基转移酶（GT）家族响应差异显著，EA2024中9个差异GT基因有6个上调而B73无变化，另一组GT基因则仅在B73差异调控（10上调/24抑制）。果胶相关基因在B73中受影响更大，而G/GalT家族受影响基因数则在EA2024中更多；MB/CWP蛋白中B73受影响基因数量始终高于EA2024。木栓质生物合成中多种GELPs酯酶在两系均被抑制。木质素途径差异最为明显（图10），B73中三种PAL被抑制且C4Hb、C3H/APX及O-甲基转移酶被诱导，提示对羟基香豆酸向阿魏酸代谢流增加，而EA2024中三种PAL被诱导（PAL2为其PTAL同源物）。三种过氧化物酶更是呈现相反响应（B73抑制/EA2024诱导）。这些结果表明干旱通过品系特异性机制调控细胞壁合成与修饰通路，其中参与纤维素、半纤维素和木质素合成的基因主要在B73中受干旱影响，而其他类别基因在两系间反应较相似。
图8.细胞壁基因（CWGs）的表达受10天干旱影响。
图9.B73/EA2024中受干旱影响的基因在功能性CWG类别中的分布。
图10.玉米木质素生物合成途径的示意图。
⑤B73与EA2024细胞壁基因时序表达动态
采用maSigPro包（R＞0.6）分析7、9、10d干旱时序细胞壁基因表达，1485个细胞壁基因中1000个被分为9个表达簇。簇1、2为非自交依赖型，簇1（160个）两份同步下调、时序一致。簇2（152个）两份同步上调、时序一致。簇3–9为自交依赖型：基因本底丰度、干旱诱导趋势两份自交系存在差异。不同功能类群自交依赖型基因占比不同：木质素基因81.5%为自交依赖型；膜细胞壁蛋白仅59.6%为自交依赖型；纤维素半纤维素、果胶、木栓胼胝质介于二者之间（图11）。
图11.B73和EA2024植物在对照条件下或经历7、9和10天干旱处理下的细胞壁基因表达谱。
⑥自交系特异性调控细胞壁基因的转录因子鉴定
基于两份自交系7、9、10d干旱差异细胞壁基因，在PlantRegMap平台完成转录因子富集分析，利用Cytoscape绘制调控网络，筛选28个高显著性自交系特异性转录因子。12个归为4个B73特异性子簇（图12），16个归为5个EA2024特异性子簇。多数子簇包含全部类别细胞壁基因，但子簇9（EA2024特异）、子簇43（B73特异）富集纤维素、半纤维素合成基因；子簇9全部为WRKY转录因子，B73特异子簇40、41、42分别为MYB、IDD、ABI家族。
3类调控苯丙烷通路的转录因子存在自交特异性：B73特异子簇42的P1（黄酮调控）、子簇40 MYB19（拟南芥、玉米苯丙烷通路激活因子）。EA2024特异子簇6 MYB31（脱落酸依赖干旱响应调控）。另有5个参与脱落酸信号的转录因子：B73特异ABI3/VP1、ABI19、MYB162。EA2024特异GBF1、HB128。PIF3、MYBST1（EA2024特异）同源基因受生物钟调控。综上，转录因子富集与调控网络分析鉴定出多套自交系特异性转录因子，可调控细胞壁基因表达。
图12.B73和EA2024自交系中特异性的转录因子和CWG调控网络。
4.结论
本研究以抗倒伏B7、易倒伏EA2024两份玉米自交系为材料，解析干旱下细胞壁差异化适应机制。生理层面，EA2024保水能力更强，干旱后可完全复水恢复，B73干旱致死，证明抗倒伏基因型耐旱性更弱。生化结果显示，正常供水EA2024纤维素、对香豆酸、糖醛酸含量更高。干旱后EA2024木质素下降，富集阿拉伯糖果胶与阿拉伯半乳聚糖蛋白。B73木质素S单体、S/G比值上升，半纤维素糖醛酸大幅积累，细胞壁重构程度更深。转录组表明干旱对B73基因扰动更强，44%细胞壁基因差异表达，显著高于EA2024的31%。木质素、纤维素合成基因存在极强基因型特异性，8个关键基因二者干旱表达趋势完全相反。时序聚类显示超80%木质素基因存在自交依赖表达模式。转录因子筛选得到MYB、WRKY、ABI等基因型特异调控因子，分别调控两条细胞壁通路。B73为实现茎秆刚性提升、获得抗倒伏特性，牺牲了细胞壁可塑性，面对干旱需剧烈重塑细胞壁。EA2024细胞壁结构灵活，依靠高阿拉伯糖果胶维持水分，耐旱性更优。研究挖掘的细胞壁基因与转录因子，可用于培育兼顾抗倒伏与耐旱的玉米新材料。