中文题目：OsLdh7在水稻中的过表达通过调节关键的代谢途径：厌氧糖酵解、乙醇发酵和氨基酸代谢来提高水稻的耐淹性

期刊：Plant,Cell&Environment

影响因子：6.9

单位：印度新德里国际基因工程和生物技术中心

DOI：https://doi.org/10.1111/pce.15358

全球气候变化导致洪涝灾害频发，使陆生植物遭受部分或完全淹水胁迫。长时间淹水限制植物对氧气和光照的获取，阻碍光合作用与呼吸作用等关键代谢过程，导致缺氧和活性氧（ROS）积累，引发膜脂氧化、叶绿素降解和叶片早衰。淹水胁迫下，ATP主要通过厌氧糖酵解和厌氧发酵途径少量生成；恢复期（复氧阶段）植物还面临ROS过量积累和营养缺乏等二次损伤。乳酸脱氢酶（Ldh）作为核心缺氧响应基因，在维持NAD⁺/NADH稳态和细胞质pH平衡中发挥关键作用。水稻是重要粮食作物，但完全淹水7天以上即可导致严重减产。虽然IR64等高产籼稻品种缺乏耐淹性，但Ldh基因在缺氧条件下活性显著升高，可能参与调控厌氧代谢。然而，目前除少数初步报道外，OsLdh酶在水稻淹水胁迫耐受中的具体作用机制尚缺乏深入研究。本研究通过在耐淹性较差的IR64水稻中过表达OsLdh7基因，系统探究OsLdh7在水稻淹水胁迫响应中的功能及其互作调控网络。

将构建好的OsLdh7过表达载体通过农杆菌介导的转化方法导入水稻品种IR64的愈伤组织中，以生成转基因株系。随后，将野生型（WT）和转基因株系在温室中培养至14天苗龄，之后对植株进行完全淹水处理：将其完全浸没在装满水的罐子中，在黑暗、静水条件下持续7天，以施加完全淹没胁迫。在胁迫处理后，将植株从水中取出，置于通气条件下进行7天的恢复培养。所有生理及生化指标的测定均分别在对照条件、淹水第7天以及恢复第7天这三个时间点进行。

（1）水稻品种IR64中OsLdh7的过表达可增强对淹水胁迫的耐受性并改善幼苗期恢复能力

为探究OsLdh7基因在水稻淹水胁迫中的功能，研究人员利用组成型启动子CAMV35S在pCAMBIA 1302载体中过表达OsLdh7，并通过农杆菌介导的转化技术将其导入水稻品种IR64，成功获得过表达株系。经qRT-PCR验证转录水平后，将野生型（WT）及过表达株系在温室培养14天（图1a），随后进行完全淹水7天处理（图1b）及7天恢复期观察（图1c）。

结果表明，淹水7天后野生型植株叶片较转基因株系更纤细、呈明显卧倒状且黄化严重（图1b）。在对照条件下以及浸水7天后，第一片叶子的存活率没有显著差异(图1d)。在第二、三片叶的存活率方面，野生型较对照组分别下降68%和72%，而转基因株系仅下降25%和35%（图1e、f）；恢复期野生型整体存活率约20%，转基因株系约58%（图1g）。叶绿素含量方面，淹水胁迫下野生型较对照组降低50%，转基因株系降低30%；恢复期两者含量均较胁迫状态增加约1.2倍（图1h）。在淀粉积累方面，淹水胁迫期间野生型茎部淀粉含量（10-11µmol/g鲜重）低于转基因品系（17.5µmol/g鲜重），恢复期转基因品系进一步升至22.5µmol/g鲜重（图1i），表明转基因株系在碳水化合物的积累与维持方面具有明显优势。

图1.OsLdh7过表达株系在对照、淹水及恢复条件下的生长与生理性能。图（a）、（b）和（c）展示了OsLdh7_Ox转基因株系（L2、L5和L6）以及野生型植株在对照、淹水及淹水恢复条件下的表现；图（d-g）的柱状图显示了野生型与转基因株系在对照、胁迫及恢复条件下第一片、第二片、第三片叶片及整株植物的存活率百分比；图（h）和（i）的柱状图则呈现了野生型与转基因株系在上述条件下的总叶绿素含量及淀粉含量。“ns”表示无统计学显著性，“*p≤0.1，**p≤0.01，***p≤0.001”。Sub：淹水；Sub-recovery：淹后恢复。

（2）OsLdh7过表达株系在淹水与恢复条件下均表现出光系统Ⅱ（PSII）的高效功能

为评估过表达株系的光系统Ⅱ（PSⅡ）效率，利用Handy-PEA测定叶绿素荧光参数，包括Fv/Fm（PSII反应中心效率，图2a）、Phi（P0）（PSⅡ量子产量，图2b）、Phi（E0）（用于驱动电子传递链的能量，图2c）、Phi（R0）（PSI电子受体还原所需能量，图2d）及PItotal（电子传递链整体性能效率，图2e）。在对照条件、淹水第7天及恢复第7天分别进行测定。

结果显示，在淹水胁迫及恢复条件下，转基因株系的Fv/Fm、Phi（P0）、Phi（E0）、Phi（R0）及PItotal均高于野生型（图2a-e）。该结果表明，OsLdh7过表达株系的光合量子产量高于野生型，说明转基因株系在胁迫条件下具有更强的维持光合性能的能力，从而赋予其更好的耐淹水能力。

图2.比较OsLdh7_Ox品系与野生型在对照、淹水及恢复条件下的光合参数。各项光合参数的测定结果表明，OsLdh7基因的过表达与耐淹水胁迫能力呈正相关。柱状图展示了野生型和OsLdh7_Ox品系的以下参数：（a）Fv/Fm；（b）（P0）；（c）（E0）；（d）（R0）；（e）总性能指数（PItotal）。数值以均值±标准误表示（n=9）。显著性水平标注如下：*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，“ns”表示无统计学意义。Sub：淹水；Sub-recovery：淹后恢复。

（3）图示OsLdh7_Ox揭示了在浸没胁迫及恢复条件下ROS清除机制的改进机制

为评估野生型与转基因株系的ROS稳态，在对照条件、淹水第7天及恢复第7天分别测定了地上部和根部组织的丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）水平。

在淹水胁迫下，野生型地上部MDA含量（8nmol/g鲜重）和根部MDA含量（11.1nmol/g鲜重）均高于转基因株系（地上部6nmol/g鲜重，根部6.8nmol/g鲜重）（图3a）。恢复期间，转基因株系地上部MDA含量较野生型降低50%，根部降低58%（图3a）。H₂O₂水平方面，淹水胁迫下野生型地上部和根部较对照分别升高约5倍和6倍，而转基因株系仅分别升高3.8倍和3.6倍（图3b）。转基因株系地上部和根部MDA与H₂O₂积累量均低于野生型，表明其ROS清除机制更为高效。

这一结果与总抗氧化能力（TAC）的测定结果相吻合。在胁迫和恢复条件下，转基因株系地上部和根部的TAC均高于野生型（图3c）。胁迫条件下，转基因株系地上部TAC约为435nmol/mg，根部约为308nmol/mg；而野生型地上部仅为143nmol/mg，根部仅为112nmol/mg（图3c）。以上结果说明，转基因株系在胁迫条件下具有更强健的抗氧化防御能力，能够更有效地清除淹水胁迫诱导产生的过量ROS，从而减轻ROS对膜脂的氧化损伤，维持细胞膜的完整性，为植株在淹水胁迫下的存活提供保障。

图3.对野生型（WT）及OsLdh7_Ox品系在对照、胁迫和恢复条件下茎叶与根组织中丙二醛（MDA）、过氧化氢（H₂O₂）含量及总抗氧化能力（TAC）的定量分析表明：在胁迫和恢复阶段，OsLdh7_Ox品系相较于WT品系表现出更强的活性氧（ROS）清除能力。柱状图分别展示（a）MDA含量、（b）H₂O₂含量以及（c）对照、胁迫和恢复条件下茎叶与根组织的总抗氧化能力；数据以均值±标准误（n=9）表示。显著性水平标注如下：**p≤0.01，“ns”表示无统计学意义。Sub：淹水；Sub-recovery：淹后恢复。

（4）在转基因品系中，乳酸和丙酮酸代谢在应激及恢复条件下均显著升高

在对照条件下，野生型与转基因株系的地上部和根部中，OsLdh7酶的正向（丙酮酸→L-乳酸）和反向（L-乳酸→丙酮酸）活性均较低（图4a、b）。

在淹水胁迫下，转基因株系正向酶活性较对照大幅提升：地上部升高8.8倍，根部升高9.2倍；而野生型仅分别升高3.6倍和3.1倍（图4a）。恢复期间，转基因株系正向酶活性仍高于野生型，地上部为野生型的2.4倍，根部为3.6倍（图4a）。反向酶活性方面，胁迫条件下转基因株系地上部和根部较对照分别升高2.6倍和2.7倍，野生型分别升高2.0倍和1.7倍（图4b）。值得注意的是，虽然转基因株系在胁迫和恢复期正反向酶活性均高于野生型，但其在淹水条件下正向酶活性较反向酶活性高出更多——地上部高4.6倍，根部高4.3倍（图4a、b），表明OsLdh7在水稻淹水胁迫下以催化丙酮酸生成L-乳酸的正向反应为主。

正向酶活性的增强直接影响了下游代谢产物浓度。在胁迫条件下，转基因株系地上部L-乳酸积累量（3.06AU）和根部积累量（3.20AU）均显著高于野生型（地上部0.7AU，根部1.20AU）（图4c）。与此同时，转基因株系地上部丙酮酸浓度（3.76AU）和根部浓度（4.30AU）也高于野生型（地上部1.78AU，根部2.35AU）（图4d）。恢复期间，转基因株系地上部和根部的L-乳酸和丙酮酸浓度均维持在较高水平，且丙酮酸积累量高于L-乳酸（图4c、d）。

正向酶活性增强还影响了NAD⁺/NADH稳态。在胁迫和恢复条件下，转基因株系地上部和根部的总NAD⁺浓度均高于野生型（图4e）。与对照相比，胁迫下转基因株系地上部NAD⁺浓度下降23%，根部下降26%；而野生型则下降幅度更大，地上部下降51%，根部下降36%（图4e）。恢复期，转基因株系地上部NAD⁺浓度较胁迫期回升18%，根部回升21%，而野生型回升幅度分别为15%和18%（图4e）。NADH浓度方面，转基因株系在胁迫和恢复期仍高于野生型，但NADH浓度远低于NAD⁺浓度（图4e、f）。

综上，OsLdh7过表达显著增强了淹水胁迫下乳酸脱氢酶的正向催化活性，促使丙酮酸更多地转化为L-乳酸，同时维持了更高的NAD⁺/NADH比值，从而保障厌氧糖酵解的持续进行和NAD⁺的再生，为植株在淹水胁迫下的能量供应和代谢稳态维持提供了关键支撑。

图4.野生型（WT）与OsLdh7_Ox品系在对照、胁迫及恢复条件下茎部和根组织中的L-乳酸及丙酮酸代谢情况。图（a）和（b）中的柱状图分别显示了野生型及转基因植株茎部与根组织中OsLdh7酶在正向（丙酮酸→L-乳酸）和反向（L-乳酸→丙酮酸）反应中的活性；图（c-f）中的柱状图则展示了野生型与OsLdh7_Ox品系在对照、胁迫及恢复阶段茎部与根组织中L-乳酸、丙酮酸、NAD⁺及NADH的含量。数据以均值±标准误表示（n=9），显著性水平标注如下：*p≤0.05，**p≤0.01and***p≤0.001；Sub：淹水；Sub-recovery：淹后恢复。

（5）OsLdh7与OsLos2、OsPdc2、OsAsp2及OsAlaAT2相互作用。这些蛋白在缺氧耐受性中发挥重要作用

为阐明OsLdh7酶的功能机制，通过计算机模拟蛋白质-蛋白质互作分析，鉴定出OsLos2、OsAsp2、OsPdc2、OsAdh1和OsAlaAT2为OsLdh7的潜在互作蛋白。为验证这些互作关系，将OsLdh7及候选基因进行扩增和克隆，用于酵母双杂交（Y2H）实验。

Y2H结果显示，OsLdh7与OsAsp2（图5a）、OsLos2（图5b）、OsAlaAT2（图5c）和OsPdc2（图5d）均表现出强烈的互作信号，但OsLdh7与OsAdh1之间未检测到互作。鉴于OsPdc2和OsAdh1均在乙醇发酵途径中发挥作用，进一步通过Y2H检测两者之间的互作关系，结果表明OsPdc2与OsAdh1存在强互作，提示二者在缺氧条件下的乙醇发酵途径中具有协同作用。随后，在洋葱表皮细胞中进行的双分子荧光互补（BiFC）实验进一步在植物体内证实了OsLdh7与OsAsp2（图5e）、OsLos2（图5f）、OsAlaAT2（图5g）及OsPdc2（图5h）的互作关系。

以上互作结果说明，OsLdh7可能通过与其他代谢相关蛋白形成互作网络，协同调控水稻在淹水胁迫下的厌氧代谢通路。

图5.OsLdh7在体内及植物体内均与OsAsp2、OsLos2、OsAlaAT2和OsPdc2发生相互作用。通过将OsLdh7克隆至AD（pGADT7）载体，将OsAsp2、OsLos2、OsAlaAT2和OsPdc2克隆至BD（pGBKT7）载体，并共同转化至酵母细胞（AH109）中，进行了酵母双杂交实验。最终将细胞培养于4Dropout（4D.O.）培养基（SD/-L/-T/-H/-A）上。OsLdh7_AD显示其在4D.O.培养基中分别与（a）OsAsp2_BD、（b）OsLos2_BD、（c）OsAlaAT2_BD及（d）OsPdc2_BD发生相互作用；（e-h）通过BiFC实验可视化蛋白质-蛋白质相互作用。共聚焦显微镜图像展示了共表达OsLdh7与（e）OsAsp2、（f）OsLos2、（g）OsAlaAT2及（h）OsPdc2的洋葱表皮细胞中重构EYFP蛋白的荧光信号，证实这些蛋白在植物体内均与OsLdh7存在相互作用。

（6）OsLdh7过表达株系在胁迫及恢复条件下表现出更优的乙醇发酵性能

由于OsLdh7与OsPdc2存在互作，且OsPdc2进一步与OsAdh1互作，因此在胁迫和恢复条件下检测了转基因株系中这两个基因的转录丰度。

在胁迫条件下，转基因株系的地上部和根部中OsAdh1表达量较对照分别升高3倍和4倍，而野生型仅分别升高2.3倍和2.8倍。相似地，转基因株系OsPdc2的转录丰度在胁迫下较对照在地上部和根部分别升高2.4倍和2.8倍。

为进一步探究这些蛋白在乙醇发酵中的作用，测定了胁迫和恢复条件下转基因株系与野生型地上部和根部的OsAdh1和OsPdc2酶活性。胁迫条件下，转基因株系OsAdh1酶活性较对照在地上部和根部分别升高7.8倍和9.8倍，而野生型仅升高4.5倍和4.8倍（图6a）。OsPdc2酶活性在转基因株系中较对照在地上部和根部分别升高9倍和10倍，而野生型在胁迫下仅升高4.7倍和5倍（图6b）。恢复期间，转基因株系的OsAdh1和OsPdc2酶活性仍高于野生型（图6a、b）。

酶活性的升高直接促进了乙醇产量的增加。在对照条件下，转基因株系与野生型的乙醇浓度无显著差异。但在胁迫条件下，转基因株系地上部乙醇含量约为8µmol/g鲜重，根部约为14µmol/g鲜重；而野生型地上部仅为3.3µmol/g鲜重，根部仅为4.8µmol/g鲜重（图6c）。恢复期间，转基因株系地上部和根部乙醇含量分别为5.4µmol/g鲜重和7.5µmol/g鲜重，野生型则分别为2.8µmol/g鲜重和3.4µmol/g鲜重（图6c）。

以上结果表明，OsLdh7过表达不仅增强了乳酸发酵途径的活性，还通过与OsPdc2的互作，协同上调了乙醇发酵途径中OsPdc2和OsAdh1的转录水平及酶活性，进而促进了乙醇的大量生成。乙醇发酵产生的ATP和NAD⁺再生对于维持淹水胁迫下的能量供应和代谢稳态至关重要，这进一步解释了OsLdh7过表达株系在淹水胁迫下具有更高存活率的原因。

图6.在对照、胁迫及恢复条件下OsLdh7_Ox品系与野生型（WT）的乙醇发酵情况。（a、b）中的柱状图分别显示了野生型和转基因品系在上述条件下茎部与根部中OsAdh1和OsPdc2酶活性的变化；（c）中的柱状图则展示了野生型与转基因品系在相同条件下的茎部与根部乙醇含量。“ns”表示无统计学显著性，“**p≤0.01，***p≤0.001”。Sub：淹水；Sub-recovery：淹后恢复。

（7）OsLdh7过表达品系在胁迫及恢复条件下均表现出升高的氨基酸代谢水平

OsLdh7与氨基酸代谢中的两个关键酶——OsAsp2和OsAlaAT2存在互作，为此检测了这些基因在胁迫和恢复条件下的转录丰度。

在胁迫条件下，转基因株系地上部和根部中OsAsp2表达量较对照分别升高2.2倍和1.5倍，而OsAlaAT2表达量较对照在地上部和根部分别升高5倍和2.8倍。恢复期间，OsAsp2在地上部和根部的表达量较对照分别升高2.3倍和1.7倍，OsAlaAT2则分别升高3.3倍和2.3倍。

为进一步阐明这些基因在胁迫耐受中的作用，在对照条件、淹水第7天及恢复第7天分别测定了转基因株系与野生型地上部和根部的氨基酸含量。OsAsp2催化天冬氨酸转化为谷氨酸，而谷氨酸又是OsAlaAT2催化生成丙氨酸的底物。测定结果显示，在胁迫条件下，转基因株系地上部和根部的天冬氨酸积累量（1783nmol/g鲜重、831nmol/g鲜重）、谷氨酸积累量（2822nmol/g鲜重、643nmol/g鲜重）和丙氨酸积累量（3695nmol/g鲜重、792.3nmol/g鲜重）均高于野生型（图7a-f）。恢复期间，转基因株系的天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸浓度仍高于野生型（图7a-f）。

以上结果表明，在淹水胁迫下，OsLdh7通过与OsAsp2和OsAlaAT2的互作，上调了这两个基因的表达，进而促进了天冬氨酸→谷氨酸→丙氨酸的代谢流向。其中，丙氨酸作为重要的厌氧代谢产物，其大量积累具有多重生理意义：一方面可作为无毒性的氮和碳储备形式，减少氨毒害；另一方面有助于维持胞质pH稳态和碳氮代谢平衡。同时，谷氨酸积累也为其他氨基酸的合成以及γ-氨基丁酸（GABA）支路提供了前体，从而多维度增强了转基因株系对淹水胁迫的适应性。

图7.在对照、浸没及浸没恢复条件下，野生型（WT）与转基因（OsLdh7_Ox）品系茎叶和根组织中三种氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸）浓度的测定结果。（a-f）中的柱状图展示了不同条件下WT株与转基因株茎叶及根组织中上述三种氨基酸的浓度。“ns”表示无统计学显著性，“*p≤0.1，**p≤0.01，***p≤0.001”。Sub：淹水；Sub-recovery：淹后恢复。