与未接种的对照组相比，接种AM真菌显著增加了植物干重、氮和磷含量以及AM真菌定殖率分别增加了25%、20%、88%和41%（图1A、B）。有趣的是，与NM（非菌剂添加）植物相比，AM定殖植物的根瘤干重增加了74%，总根瘤和大根瘤（直径>2毫米）的数量分别增加了81%和75%，固氮酶活性增加了13.8倍（图1C-G）。这些数据表明，AM接种促进了大豆的结瘤和固氮。

为了阐明菌根定殖促进结瘤的机制，测定了NM和AM处理植物的转录组。主成分分析（PCA）表明，NM样品沿第一主成分与AM样品明显分离（图1H），表明AM接种改变了大豆根部的基因表达。与NM根相比，AM根中有175个上调的DEGs和368个下调的DEGs（图1I）。RNA-seq的结果与qRT-PCR数据高度一致，表明转录组分析数据是可靠的。有趣的是，KEGG富集分析表明，与NM根相比，AM根中苯丙烷类生物合成途径是最为活跃（图1J）。与NM根相比，编码苯丙烷类生物合成的第一酶---苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）GmPAL2.4，在AM根中的表达上调（图1K）。

图1. 菌根接种对大豆植株生长、结瘤特性的影响和转录组分析。（A）植物干重。（B）植物氮（N）含量。（C）根瘤生长。白色刻度尺=1cm。（D）根瘤干重。（E）每株植物的根瘤总数。（F）每株植物的大根瘤数量。（G）固氮酶活性。在A-G中，数据是具有标准误差的四次重复的平均值。星号表示非菌根（NM）和菌根（AM）接种处理之间存在的显著差异（Student’s t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。（H）主成分分析（PCA）。（I）显示上调和下调基因的火山图。红点代表上调的基因，蓝点代表下调的基因。（J）KEGG富集气泡图。纵坐标表示富集途径，横坐标表示基因比率。每个点的大小表示路径中DEGs的数量，点的颜色表示调整后的p值。p≤0.05的KEGG通路被认为是显著富集。（K）GmPAL2.4的相对表达量。qRT-PCR分析中包括四个生物重复。星号表示NM和AM处理之间存在显著差异（Student's t检验，*p<0.05）。

为了探索根系分泌物在结瘤相关过程中的作用，在测定植物干重和AM真菌定殖之前，从6周龄的植物中收集了接种NM和AM的大豆根系分泌物，并在体外根瘤菌培养实验中进一步分析。图2A所示的结果表明，与NM根系分泌物相比，不同浓度的AM定殖根系分泌物显著增加了根瘤菌的生长。在0.5倍和1.5倍的菌根定殖浓度下，根系分泌物也能有效增强根瘤菌的趋化性，在2.5倍、5倍和10倍的浓度时，相比于没有菌根定殖时的根系分泌物中根瘤菌的生物膜形成也有所提升（图2B、C）。在RC⁺/HC^-和RC⁺/HC⁺处理的培养皿实验中进一步收集了菌丝分泌物。在体外根瘤菌培养实验中，RC⁺/HC^-和RC⁺/HC^-处理的根瘤菌光密度（OD）在1-20h内没有变化 。在没有菌丝分泌物的RC⁺/HC^-处理中，根瘤菌OD从20h开始略有增加，然后从28h稳定到72h ，表明菌丝分泌物对根瘤菌生长的影响很小。菌丝分泌物显著增加了根瘤菌的趋化性，但对根瘤菌的生物膜形成没有影响（RC：根室中的菌根毛状根，HC：菌丝隔室中有AM真菌菌丝）。

进一步通过双层盆栽实验，以确定添加根系分泌物是否影响结瘤特性。结果表明，与未接种菌根的对照和根系分泌物中添加H₂O相比，接种菌根的根系分泌物分别显著增加了85%和49%的大根瘤数量，以及85%和64%的大根瘤干重（图2D-F）。此外，与NM处理根系分泌物相比，AM定殖处理根系分泌物的添加使固氮酶活性增加了41%（图2G）。

图2. 未接种（NM）和接种丛枝菌根（AM）的大豆根系分泌物对根瘤菌生长、趋化性、生物膜形成和结瘤的影响。（A）根瘤菌生长。数据计算为1至72h的培养物光密度（OD）减去根瘤菌液体培养物的初始OD。（B）根瘤菌趋化性。（C）根瘤菌生物膜形成。（D）根瘤生长。白色刻度尺=1cm。（E）每株植物的大根瘤数量。（F）大根瘤的干重。（G）固氮酶活性。在B、C、E-G中，数据是具有标准误差的四次重复的平均值。通过邓肯多重范围检验，具有相同字母的条形图在不同处理之间没有显著差异（p<0.05）。

04

特定黄酮和酚酸影响结瘤相关过程

与NM根相比，AM处理根中的苯丙烷生物合成途径显著富集（图1J）。黄酮类化合物和酚酸是该途径中产生的重要代谢产物，也是豆类结瘤的关键信号。因此，我们通过高效液相色谱法检测了根系分泌物中的12种黄酮类化合物和酚酸，包括大豆苷元、染料木素、柚皮素、山奈酚、芦丁、苯甲酸、对羟基苯甲酸、异绿原酸B、咖啡酸、香豆酸、香草酸、肉桂酸。结果表明，与未接种AM的处理相比，接种AM处理的根系分泌物中黄酮类化合物大豆苷元和染料木素的浓度分别增加了19%和56%，酚酸苯甲酸和对羟基苯甲酸的浓度分别提高了35%和77%（图3A-D）。然而，与NM根系分泌物相比，AM定殖根系分泌物中其他黄酮类化合物和酚酸的浓度没有显著差异。相比之下，RC⁺/HC⁺（含有菌丝分泌物）中对羟基苯甲酸的浓度是RC⁺/HC^-处理的17倍。

进一步的研究表明，大豆苷元和染料木素的施用增加了根瘤菌的生长（图3E，F）。施用大豆苷元和染料木素后，根瘤菌OD从52h显著增加 ，在60h时表现出最高水平 、但在浓度高于0.01μM时略有下降（图3E、F）。苯甲酸的施用也增加了44h后的根瘤菌OD ，在浓度为1.0μM时，在60h时达到最高水平（图3G），而施用对羟基苯甲酸（p-Hydroxybenzoic acid）对根瘤菌生长没有影响。此外，在较高浓度下，染料木素、苯甲酸和对羟基苯甲酸的施用显著增加了根瘤菌的趋化性（图3H，I）。此外，在较高浓度下，染料木素、苯甲酸和对羟基苯甲酸的施用显著增加了根瘤菌的趋化性（图3H，I）。与0.01μM的浓度相比，大豆苷元在0.01μM和0.02μM浓度下显著增加了根瘤菌的趋化性（图3H）。添加更高浓度的大豆苷元和对羟基苯甲酸也增强了根瘤菌的生物膜形成（图3G，K）。然而，在施用浓度范围内，染料木素对根瘤菌的生物膜形成没有影响。随着苯甲酸浓度的增加，根瘤菌的生物膜形成先增加后减少（图3K）。

图3. 未接种（NM）和接种丛枝菌根（AM）的大豆根系分泌物中大豆苷元、染料木素、苯甲酸和对羟基苯甲酸的浓度，以及它们的添加对根瘤菌生长、趋化性和生物膜形成的影响。（A）大豆苷元浓度。（B）染料木素浓度。（C）苯甲酸浓度。（D）对羟基苯甲酸浓度。在A-D中，数据是四个具有标准误差的重复的平均值。星号表示NM和AM处理之间存在显著差异（Student's t检验，**p<0.01）。（E）添加大豆苷元的根瘤菌生长。（F）添加染料木素的根瘤菌生长。（G）添加苯甲酸的根瘤菌生长。数据计算为1-72h的培养物OD减去根瘤菌液体培养物的初始OD。（H）添加黄酮类化合物的根瘤菌趋化性。（I）添加酚酸的根瘤菌趋化性。（G）添加黄酮后根瘤菌生物膜的形成。（K）添加酚酸形成根瘤菌生物膜。在H-K中，数据是具有标准误差的四次重复的平均值。通过邓肯多重极差检验，同一化合物中具有相同字母的条形图在浓度上没有显著差异（p<0.05）。

05

合成根分泌物促进结瘤和N₂固定

在10d和42d的土壤培养温室实验中，我们评估了添加含有大豆苷元、染料木素、苯甲酸和对羟基苯甲酸的合成根分泌物（SRE）对结瘤和固氮的作用。与对照组相比，添加SRE显著增加了植物干重和磷含量，分别增加了18%和25%，但不影响AM真菌定殖。SRE的添加也促进了大豆结瘤和固氮作用，并分别使结瘤干重、总结瘤数和大结瘤数增加了2.1倍、1.9倍和1.8倍（图4A-D）。我们观察到，与对照组相比，SRE处理组根瘤中的固氮酶活性也有类似的增加（图4E）。最后，添加SRE使植物氮含量显著增加了20%（图4F）。此外，添加SRE后10天和42天，SRE处理根际根瘤菌的相对丰度明显高于对照组（图4G）。这些结果表明，添加特定的根系分泌物增加了根际根瘤菌的相对丰度，促进了大豆的结瘤和固氮。在灭菌沙培实验中，合成根系分泌物对植物干重没有影响。

为了研究添加SRE是否通过激活结瘤信号通路从而对结瘤产生积极影响，我们分析了SRE添加后10天根中核心结瘤基因的表达，如共生受体样激酶基因（SymRK）GmSymRKα、GmSymRKβ，Ca²⁺/钙调素依赖性蛋白激酶基因（CCaMK）GmCCaMKα、GmCCaMKβ，根瘤信号通路1基因（NSP1）GmNSP1a和GmNSP1b，结瘤起始基因（NIN）GmNIN1a和GmNIN2a。结果表明，与对照组相比，添加特定的根系分泌物显著提高了这些核心结瘤基因的转录水平（图4H-O）。

图4. 合成根系分泌物（SRE）对土壤栽培大豆结瘤固氮及共生相关基因表达的影响。（A）根瘤生长性能。白色刻度尺=1cm。（B）根瘤干重。（C）每株植物的根瘤总数。（D）每株植物的大根瘤数量。（E）固氮酶活性。（F）植物氮（N）含量。（G）根瘤菌的相对丰度。（H）GmSymRKα的相对表达量。（I）GmSymRKβ的相对表达量。（J）GmCCaMKα的相对表达量。（K）GmCCaMKβ的相对表达量。（L）GmNSP1a的相对表达量。（M）GmNSP1b的相对表达量。（N）GmNIN1a的相对表达量。（O）GmNIN2a的相对表达量。数据是四次重复的平均值，有标准误差。在B-F、H-O中，星号表示CK和SRE处理之间存在显著差异（Student's t检验，*p<0.05，**p<0.01）。在G中，通过邓肯多重检验，不同处理之间具有相同字母的条形图没有显著差异（p<0.05）。

06

GmPAL2.4与特定黄酮和酚酸的渗出有关

为了研究GmPAL2.4在特定黄酮和酚酸生产中的作用，我们比较了GmPAL2.4过表达的转基因植物（OX）和载体对照（EV）之间总黄酮、总酚酸、大豆苷元、染料木素、苯甲酸和对羟基苯甲酸的浓度。GmPAL2.4在过表达根中的表达水平显著高于EV根。与EV相比，GmPAL2.4的过表达显著增加了转基因植物根部总黄酮、总酚酸、大豆苷元、染料木素、苯甲酸和对羟基苯甲酸的浓度。

我们在根瘤菌接种后30天，用转基因植株进一步评估了GmPAL2.4过表达对结瘤和固氮的影响（图5）。qRT-PCR分析显示，OX系中GmPAL2.4的转录水平比EV系高2.9倍（图5B）。与EV系相比，OX系的植物干重和氮含量分别增加了64%和110%，根瘤干重和根瘤数分别增加了4.5倍和3.2倍（图5C-G），表明GmPAL2.4通过增强特定黄酮类化合物和酚酸的分泌在结瘤和固氮中发挥作用。

图5. 过表达GmPAL2.4对植物生长、结瘤特性以及黄酮（大豆苷元和染料木素）和酚酸（苯甲酸和对羟基苯甲酸）生物合成途径中关键基因表达的影响。（A）植物生长性能。白色刻度尺=10cm（B）GmPAL2.4的相对表达量。（C）植物干重。（D）植物氮（N）含量。（E）根瘤生长。白色刻度尺=2cm。（F）根瘤干重。（G）每株植物的根瘤数。在B-D、F、G中，数据是具有标准误差的四次重复的平均值。星号表示空载体（EV）和过表达（OX）大豆品系之间存在显著差异（Student's t检验，*p< 0.05，**p<0.01，***p <0.001）。（H）特定黄酮类化合物（大豆苷元和染料木素）和酚酸（苯甲酸和对羟基苯甲酸）生物合成示意图。DEGs用红色标记。PAL，苯丙氨酸解氨酶；C4H，肉桂酸-4-羟化酶；4CL，4-香豆素-CoA连接酶；CHS，查尔酮合酶；CHR，查尔酮还原酶；CHI，查尔酮异构酶；IFS，异黄酮合酶；HID，2-羟基异黄酮脱水酶；CHD，肉桂酰辅酶A水合酶/肉桂酰辅酶A脱水酶；KAT，3-酮酰基-CoA硫解酶；BZL，苯甲酰辅酶A连接酶；EC水合酶、烯酰辅酶A水合酶；EC裂解酶，烯酰辅酶A；AAO，醛氧化酶；BA4H，苯甲酸4-羟化酶。