该研究通过系统的表型观察、转录组分析和表观遗传检测，揭示了DML2-RIN/FUL1调控模块在番茄果实成熟中的核心作用。图1显示，dml2突变体与rin/ful1双突变体均表现出相似的成熟障碍表型，表明DML2可能通过调控这两个转录因子发挥作用。转录组聚类热图和RT-qPCR数据证实，在dml2突变体中RIN和FUL1的表达量显著降低，仅为野生型的20%以下（P<0.001）。进一步的亚硫酸氢盐测序分析发现，dml2突变体中RIN和FUL1启动子区域DNA甲基化水平明显升高，甲基化位点密度与基因沉默程度直接相关。这些结果首次从分子水平证实了DML2通过去甲基化作用激活RIN和FUL1的表达，而这两个转录因子在调控果实成熟过程中表现出功能冗余性，共同介导了表观遗传信号向下游成熟相关基因的传递，从而建立了“DML2介导的启动子去甲基化-RIN/FUL1激活-成熟程序启动”的级联调控模型，为理解果实成熟的表观遗传调控机制提供了重要理论基础。

图2.dml2-3与rin/ful1-1突变体果实成熟过程中转录组的比较分析。（A）差异表达基因火山图：展示dml2-3和rin/ful1-1突变体与野生型AC在34dpa（开花后天数）的差异表达基因（DEGs）分布。（B）韦恩图：比较dml2-3和rin/ful1-1突变体相对于AC在34dpa时上调和下调DEGs的重叠情况，其中4,390个上调基因和4,389个下调基因在两种突变体中共有差异表达。（C）聚类热图：基于（B）中鉴定的共有的DEGs，展示AC（25/34dpa）、dml2-3（34dpa）和rin/ful1-1（34dpa）果实中的基因表达变化。（D）转录组聚类分析：根据三个生物学重复的平均表达水平，对AC、dml2-3、rin-cr1、ful1-1、nor-cr1和rin/ful1-1在34dpa的转录组数据进行层次聚类分析。

本研究通过遗传回补实验证实了RIN转录因子在DML2介导的番茄果实成熟表观遗传调控中的核心作用。在dml2-3突变体中回补RIN（pCBC::RIN-3xFLAG）可部分恢复成熟表型，表现为：果实颜色转变介于野生型（AC）与突变体之间（A）；45dpa时β-胡萝卜素和番茄红素积累量恢复至野生型的60%（B）；乙烯释放量和ACC含量分别提升至野生型的30-50%和40%（C-D）。qRT-PCR分析显示RIN回补不影响DML2本身的表达水平（E），直接证实了DML2→RIN→乙烯/色素合成的线性调控路径。这些结果不仅确立了RIN作为DML2下游关键效应分子的地位，也为利用转录因子工程改良表观遗传缺陷型作物提供了理论依据（***P<0.001，单尾t检验，n=3）。

图3. RIN表达回补部分恢复dml2-3突变体的成熟表型。（A）果实表型分析。AC（野生型）、dml2-3突变体及两个RIN回补株系（pCBC::RIN-3xFLAG/dml2-3 line1/2）在25、34、38和45dpa（开花后天数）的表型变化。标尺：1cm。（B）类胡萝卜素积累测定，45dpa时AC、ful1-1、rin-cr1、rin/ful1-1、dml2-3、dml2-4及RIN回补株系（line1）果实中β-胡萝卜素和番茄红素的含量。数据以均值±标准差表示（n=3）。（C）乙烯释放动力学，检测25-45dpa期间各基因型果实的乙烯生成速率。关键时间点（34/38dpa）显示dml2-3乙烯产量不足野生型5%，而回补株系恢复至30-50%。（D）ACC含量分析：测定38dpa时乙烯前体1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）的积累水平。dml2-3中ACC含量较野生型降低95%以上（***P<0.001），回补后显著回升。

通过比较rin/ful1-1双突变体和dml2-3突变体在乙烯利处理下的表型响应，揭示了RIN和FUL1转录因子在番茄果实成熟表观遗传调控中的关键作用。实验采用绿熟期（MG，30dpa）果实，分别进行外源乙烯利（ethephon，2mM，释放乙烯）和1-MCP（5ppm，乙烯抑制剂）处理。结果显示，rin/ful1-1双突变体与dml2-3突变体表现出相似的乙烯响应缺陷，其成熟进程显著受阻，表现为着色障碍和软化延迟，且对1-MCP处理的敏感性降低。这一现象表明RIN和FUL1可能通过调控DNA甲基化状态（如与DML2协同作用）来影响乙烯信号通路的表观遗传修饰，进而调控ACS2、ACO1等乙烯合成基因的表达。该结果从分子水平阐明了转录因子与表观遗传修饰的协同调控机制在果实成熟过程中的重要作用，为理解植物发育的复杂调控网络提供了新的见解。

图4.rin/ful1-1双突变体果实对外源乙烯的响应与dml2-3突变体相似，外源乙烯利处理对野生型（AC）、rin-cr1、ful1-1、rin/ful1-1双突变体及dml2-3突变体果实成熟的影响；所有果实均于绿熟期（MG，30dpa）采收，分别进行2mM乙烯利（ethephon）处理5分钟或5ppm 1-MCP持续处理8天。图示为代表性果实表型（比例尺：2cm）。

通过ChIP-seq和ChIP-qPCR技术揭示了DNA去甲基化酶DML2对RIN转录因子靶基因结合的差异性调控机制。在pCBC::RIN-3xFLAG/dml2-3双突变体（花后34天）中，全基因组分析显示RIN在部分靶基因启动子区（±2.0kb）的结合显著降低，而其他靶基因不受影响。IGB可视化和定量验证进一步将RIN靶基因分为两类：DML2非依赖性靶基因（如AP2a、PG2a）的结合得以维持，而DML2依赖性靶基因（如NAC-NOR、Z-ISO）的结合在dml2-3突变体中完全丧失（***P<0.001）。这些结果表明DML2通过特异性调控靶基因启动子区的DNA甲基化状态，决定RIN转录因子的结合能力，从而建立了一个层级性的果实成熟表观遗传调控网络。该发现为理解DNA甲基化如何精确调控转录因子-靶基因互作提供了直接证据，并为通过表观遗传编辑定向调控果实成熟提供了新思路。

图5.DML2介导RIN转录因子对靶基因的特异性结合调控。（A）热图分析显示pCBC::RIN-3xFLAG和pCBC::RIN-3xFLAG/dml2-3果实（花后34天）中RIN的ChIP信号分布。实验采用FLAG标签抗体进行染色质免疫沉淀，展示RIN结合峰中心±2.0kb范围内的信号强度。（B-C）IGB可视化分析RIN在下游靶基因（AP2a、PG2a、NAC-NOR和Z-ISO）启动子区的富集情况。与pCBC::RIN-3xFLAG相比，pCBC::RIN-3xFLAG/dml2-3果实中：AP2a和PG2a启动子区维持RIN结合。（B）但在NAC-NOR和Z-ISO启动子区RIN结合显著缺失。（C）以AC中的ChIP信号作为阴性对照。（D）ChIP-qPCR定量分析AP2a、PG2a、NAC-NOR和Z-ISO启动子区RIN富集水平。实验材料包括AC、pCBC::RIN-3xFLAG和pCBC::RIN-3xFLAG/dml2-3果实（34dpa），以SlACTIN2作为非特异性对照。信号强度以input DNA百分比表示，数据为三次生物学重复均值±标准差。采用单尾t检验评估显著性（***P<0.001）。

通过对68,230个dml2-3特异性高甲基化区域（DMRs）的分析，研究发现随着甲基化程度增加（分为无显著增加<0.05、中度增加0.05-0.2和显著增加>0.2三组），RIN结合信号呈现梯度性降低。全基因组相关性分析显示甲基化水平升高与RIN富集呈显著负相关（随机区域无此现象），典型基因座（Solyc01g094320和Solyc03g079850）的BS-seq和ChIP-seq数据进一步证实dml2-3突变体中胞嘧啶甲基化升高与RIN结合缺失的直接关联。这些结果首次建立了DNA甲基化水平与RIN结合的定量关系模型，阐明DML2通过维持靶基因启动子区的低甲基化状态确保RIN正常结合，为表观遗传调控转录因子活性的机制提供了直接证据。该多组学整合研究（甲基化组+蛋白质-DNA互作组）通过甲基化梯度分组和严格对照，揭示了DNA甲基化对转录因子结合的剂量效应。

图6.dml2-3突变体中RIN结合的缺失与DNA甲基化水平升高高度相关。（A）箱线图展示68230个dml2-3特异性高甲基化区域（DMRs）在AC（野生型）、dml2-3和pCBC::RIN-3xFLAG/dml2-3中的DNA甲基化水平，包括C、CG、CHG和CHH四种甲基化类型的比较分析。（B）谱线图显示AC和dml2-3中三类RIN结合区域的RIN平均信号强度：甲基化未增加组（差异<0.05），中度增加组（0.05<差异<0.2），显著增加组（差异>0.2）。（C）平滑散点图定量分析dml2-3中DNA甲基化增益与RIN富集的相关性。使用34dpa的pCBC::RIN-3xFLAG果实中RIN结合峰进行分析，随机选择区域作为对照，并标注相关系数。（D）IGB整合基因组浏览器展示dml2-3中Solyc01g094320和Solyc03g079850基因启动子区的RIN ChIP信号与BS-seq甲基化数据，直观呈现胞嘧啶甲基化对RIN富集的影响。

全基因组ChIP分析鉴定出1,144个RIN结合被阻断区域和7,836个维持结合区域，箱线图定量显示阻断区域在结合位点±100bp范围内CG甲基化水平显著升高（dml2-3 vs AC），而维持结合区域无此变化。多组学相关性分析证实RIN结合信号变化与DNA甲基化增益（负相关）和H3富集度降低（正相关）严格限定在±100bp范围内。EMSA实验进一步验证甲基化CArG-box（mCArG-box）使GST-RIN（1-157aa）结合亲和力降低50倍以上。这些结果首次建立了“甲基化-组蛋白修饰-转录因子结合”的三维协同调控模型，为理解表观遗传修饰的空间效应提供了分子证据。该研究通过体内外实验相结合，系统阐明了DML2缺失导致的局部高甲基化通过形成表观遗传屏障特异性阻断RIN结合的分子机制。