英文题目：Spatial mapping of metabolite distribution in Dendrobium officinale stems across different ages by MALDI-MSI
中文题目：利用MALDI-MSI技术解析不同年限铁皮石斛茎中代谢物的空间分布图谱
期刊名称：Food Research International
影响因子：8.0
作者单位：安徽农业大学生命科学学院
普奈斯提供服务：切片+靶向（新亚麻氰苷，山奈酚，纤维二糖检测）
DOI号：https://doi.org/10.1016/j.foodres.2025.117209
铁皮石斛（Dendrobium officinale）是一种药食同源植物，其茎部富含多糖、生物碱和类黄酮等活性成分，具有广泛的药用和营养价值。然而，这些代谢物在不同生长年限和不同组织中的空间分布规律尚不明确。传统代谢组学方法无法保留空间信息，而MALDI-MSI技术将质谱分析与二维空间成像相结合，能够在无需复杂样品预处理的情况下，实现对样本中代谢物的定性定量分析以及空间分布可视化，为本研究提供了技术支撑。
研究选取了不同生长年份（一年Do-1、两年Do-2和三年Do-3）的石斛新鲜茎样本，经固定、脱水、石蜡包埋等步骤后进行切片处理（图1）。随后对石斛茎切片进行番红-固绿染色分析，通过横截面观察，从外至内可见铁皮石斛茎的表皮、薄壁组织及散布其间的维管束（图2A-C）。染色结果显示，不同生长年限的铁皮石斛茎中维管束的数量和形态存在差异（图2D-F）。统计分析表明，随着植株年龄的增长，铁皮石斛茎中维管束的数量显著增加（图2G）。此外，统计结果还显示，随着年限的增加，维管束鞘中厚壁细胞的细胞壁厚度也显著增加（图2H）。值得注意的是，二年生茎样本（Do-2）的细胞壁厚度增加最为显著，这与其生长状态一致。需指出的是，二年生铁皮石斛茎处于生长高峰期，维管束密度的增加确保了植株各部分获得充足的水分和养分，以维持正常的生长发育。维管束厚壁细胞的细胞壁为厚壁组织细胞，其木质化细胞壁含有木质素和纤维素。这些物质的存在使维管束细胞壁极为坚韧，从而提供机械支撑和保护作用，使植株能够抵抗外部环境的压力并保持直立姿态。
图1.通过MALDI-MSI分析代谢物的典型数据可视化流程图。图2.铁皮石斛茎横切面的番红-固绿染色及统计图表。（A-C）显示Do-1、Do-2和Do-3样本整体组织结构的横切面图，比例尺为500μm；（D-F）为Do-1、Do-2和Do-3的局部放大图，比例尺为20μm；图（G）表示Do-1、Do-2和Do-3样本中维管束的数量；图（H）显示三个样本中维管束鞘厚壁细胞的细胞壁厚度。***表示差异极显著（P<0.001），ns代表无显著差异。
对不同生长年限铁皮石斛茎样品的生理指标（总多糖、生物碱及黄酮含量）分析结果表明，三年生样本中生物活性物质的积累更为显著。铁皮石斛茎中总生物碱含量范围为0.0396%至0.0512%（图3A）。不同生长年限的茎样本间总生物碱含量无显著差异。总多糖含量在一年生（Do-1）至二年生（Do-2）样本中介于25.854%至30.917%之间，三年生（Do-3）样本中略有下降（图3B）。一年生茎的多糖含量最低，而二年生与三年生茎间无显著差异。相比之下，总黄酮含量变化范围为0.17%至0.53%，且随生长年限增加呈现显著上升趋势（图3C）。
图3.不同生长年限铁皮石斛样本中总生物碱、总多糖和总黄酮含量的变化。（A）总生物碱、（B）总多糖和（C）总黄酮在铁皮石斛茎样本（Do-1、Do-2、Do-3）中的含量，数据来源于三次独立实验的重复测定。误差棒表示均值标准误（SEM）。显著性差异水平：*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001；ns表示无显著差异（P≥0.05）。对不同生长年限铁皮石斛茎中多糖的PAS染色结果表明，多糖主要储存于基本组织的薄壁细胞中，并以颗粒形式分布（图4）。一年生铁皮石斛茎样本（图4A）中多糖颗粒数量较少且分布较为分散，而二年生和三年生样本中分布更为密集。二年生茎中多糖颗粒数量略有增加（图4B），三年生茎中则观察到更高密度的多糖分布，且颗粒呈聚集状态（图4C）。这些结果证明，铁皮石斛茎中多糖的分布与植株年龄呈正相关。
图4.铁皮石斛茎多糖的PAS染色切片。（A）一年生样本，（B）二年生样本，（C）三年生样本；图中比例尺为100μm。本研究采用基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）技术，对三年生铁皮石斛茎的横切面和纵切面样本进行分析。如图5A所示，共鉴定到1039种代谢物，其中碳水化合物占2.12%，生物碱占8.95%，类黄酮占3.46%。糖类、生物碱和类黄酮是铁皮石斛的主要药用成分，可作为其品质评价指标。本研究利用MALDI-MSI技术分析不同生长年限铁皮石斛茎中代谢物的变化，为确定最佳采收期提供依据。聚类热图分析显示，糖类、生物碱和类黄酮的含量随植株年限增加而上升（图5B）。一年生茎（Do-1）中这些代谢物水平低于二年生和三年生茎（Do-2和Do-3），虽无显著差异，但一定程度上反映了MALDI-MSI数据的可靠性。层次聚类将Do-2和Do-3归为一类（图5C），表明二者具有相似的代谢物组成和浓度，提示三年可能是铁皮石斛代谢谱趋于稳定的阈值。不同年限石斛茎的MALDI-MSI质谱图（图6）。
图5.不同年限石斛中代谢物类别的定量分类、聚类热图和代谢物双向相关性分析。（A）不同生长年限铁皮石斛中代谢物类别的定量分类。（B）样本（Do-1、Do-2、Do-3）中次生代谢物的聚类热图。颜色深浅表示相对含量高低，红色代表相对含量较高，绿色代表相对含量较低。（C）铁皮石斛样本（Do-1、Do-2、Do-3）中代谢物的双向相关性分析。颜色深浅反映代谢物间相关性程度，红色调表示较强的正相关，绿色调表示较强的负相关。图6.三年生铁皮石斛茎样本（Do-1、Do-2、Do-3）茎组织切片的代谢物MALDI-MSI质谱图。
本研究采用T检验和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）鉴定差异代谢物（DAMs）。将满足|log2(差异倍数)|≥1.0（即差异倍数≥2.0或≤0.5）且校正后P值＜0.05的代谢物定义为显著DAMs。通过上述分析，在一年生与二年生铁皮石斛茎中共鉴定到500个DAMs，在一年生与三年生茎中鉴定到571个DAMs。KEGG通路分析表明，这些DAMs主要富集于“代谢途径”和“次生代谢物生物合成”通路（图7A-B），表明铁皮石斛发育过程中存在年龄依赖的代谢生物合成。这种代谢生物合成通过调控生物合成途径以满足不同环境条件下的生理需求。两个比较组（Do-1vsDo-3和Do-1vsDo-2）中共有313个代谢物重叠（图7C），表明保守的代谢适应是发育转变的基础。特别值得注意的是这些重叠代谢物，它们包含铁皮石斛特有的生物活性化合物，如生物碱（例如托烷类生物碱衍生物爱康宁甲酯）、糖类（如D-半乳糖）和类黄酮。山奈酚（黄烷醇苷元）也被检测到。KEGG富集分析将这些共有DAMs与关键通路关联：“托烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成（ko00960）”、“淀粉和蔗糖代谢（ko00500）”、“半乳糖代谢（ko00052）”、“类黄酮生物合成（ko00941）”以及“黄酮和黄烷醇生物合成（ko00944）”是铁皮石斛活性成分生成的重要途径。
图7.（A）差异代谢物（DAMs）的KEGG富集分析。条形图展示了不同代谢通路及基因相关功能的百分比分布。红框标注的通路表示存在显著差异。（B）Do-1与Do-3样本的KEGG分类比较。与（A）类似，展示了KEGG百分比分布，红框标注的通路表示显著差异。（C）Do-1、Do-2和Do-3样本（Do-1 vs Do-3和Do-1 vs Do-2）的韦恩图，显示共有及特有代谢物。图中数字（258、313、187）代表特定样本组合中特有或共有的代谢物数量。新亚麻氰苷、海藻糖、纤维二糖和山奈酚在铁皮石斛茎中的空间可视化与分布
生物碱是一类含氮有机化合物，在植物中具有多种生物活性，包括防御和生长调节功能。新亚麻氰苷（m/z 446.2104）是一种生物碱。研究表明，新亚麻氰苷在保护植物免受草食动物和病原体侵害方面起关键作用。在铁皮石斛茎中，新亚麻氰苷主要分布于维管束区域，且含量随植株年限增加而逐年上升（图8A）。糖类对植物生长发育至关重要，海藻糖（m/z 365.1062）和纤维二糖（m/z 381.0796）的空间分布图像显示，二者在铁皮石斛茎中分布均匀，未出现明显组织分化，且藻酸盐水平较高。总多糖含量测定结果表明，一年生茎（Do-1）中含量较低，二年生茎（Do-2）中较高，三年生茎（Do-3）略有下降但无显著差异（图3B），这一结果与MALDI-MSI离子成像数据一致（图8A）。类黄酮在帮助植物适应环境变化、抵抗胁迫和维持生理稳态中发挥重要作用。山奈酚（m/z 286.9911）是一种具有显著生物活性的类黄酮化合物。研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、神经保护和免疫调节特性。对山奈酚空间分布的成像结果显示，其含量随生长年限增加而上升。在二年生茎中，山奈酚在表皮区域附近浓度较高，其他区域分布均匀；而在三年生茎中，表皮区域分布显著减少，其他区域仍保持均匀分布。从MALDI-MSI结果中提取新亚麻氰苷、海藻糖、纤维二糖和山奈酚的相对丰度，并通过条形图展示（图8B）。如图8B所示，新亚麻氰苷和海藻糖的丰度随年限增加而逐年上升。二年生茎中海藻糖和纤维二糖浓度最高，三年生茎中略有下降。
铁皮石斛茎中新亚麻氰苷、海藻糖、纤维二糖和山奈酚的LC-MS/MS分析
采用LC-MS/MS技术对不同生长年限铁皮石斛茎中四种代谢物（新亚麻氰苷、海藻糖、纤维二糖和山奈酚）的相对含量进行了定量分析（图8C）。海藻糖和纤维二糖的含量随生长年限增加而上升；相反，新亚麻氰苷和山奈酚的含量呈现相反趋势，一年生茎中最低，二年生茎中最高。三年生茎中新亚麻氰苷和山奈酚含量略有下降，但无显著差异。LC-MS/MS分析结果在一定程度上验证了MALDI-MSI数据的可靠性。
铁皮石斛茎中新亚麻氰苷、海藻糖、纤维二糖和山奈酚的HPLC分析
采用高效液相色谱法（HPLC）对四种关键化合物（新亚麻氰苷、海藻糖、纤维二糖和山奈酚）进行定量分析。绝对定量结果与通过MALDI-MSI观察到的相对丰度趋势一致。如图8D所示，铁皮石斛茎中新亚麻氰苷和海藻糖含量随栽培年限逐步增加，在三年生茎中达到峰值；相反，纤维二糖和山奈酚的积累在二年生茎中达到最高。
图8.石斛茎中新亚麻苦苷、海藻糖、纤维二糖和山奈酚的MALDI-MSI分析、LC-MS/MS分析和HPLC分析。（A）新亚麻氰苷（m/z 446.2104）、海藻糖（m/z 365.1062）、纤维二糖（m/z 381.0796）和山奈酚（m/z 286.9911）的MALDI-MSI分析；（B）通过离子迁移谱（IMS）测量提取的各代谢物相对含量；（C）通过LC-MS/MS测定的铁皮石斛茎（Do-1、Do-2、Do-3）中代谢物相对含量；（D）通过HPLC测定的铁皮石斛茎（Do-1、Do-2、Do-3）中代谢物绝对含量。图中比例尺为1-mm，误差棒表示均值标准误（SEM），显著性差异水平：*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001；ns表示无显著差异（P≥0.05）。通过统计分析m/z和采集的峰值光谱强度信息，将相似的质谱归为一类并用相同颜色标注，最终形成不同的空间分割区域。结合铁皮石斛茎的冷冻切片和组织化学染色结果，选取两个感兴趣区域（表皮和维管束）进行进一步分析。海藻糖和纤维二糖在铁皮石斛茎中的分布相对均匀，两种化合物均分布于表皮和维管束中，且其含量随生长年限增加而上升（图9A和B）。海藻糖和纤维二糖的含量变化趋势一致，而新亚麻氰苷主要分布于维管束中，在表皮中含量较低。据此可合理推测，新亚麻氰苷可能通过维管束进行运输。
图9.通过离子迁移谱（IMS）测量提取的新亚麻氰苷、海藻糖、纤维二糖和山奈酚在（A）表皮和（B）维管束区域中的相对化合物含量。植物代谢物的共定位分析采用皮尔逊相关系数和曼德斯共定位系数，用于定量分析并探索代谢物之间的关联性，研究不同生长阶段植物中多种代谢物的共存关系或其空间分布的重叠情况。本研究对糖类物质（海藻糖和纤维二糖）进行了共定位分析，结果如图10所示。在铁皮石斛的不同生长时期，海藻糖与D-半乳糖、半乳糖基-β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖表现出明显的共定位现象，它们的空间分布及含量变化高度相似。纤维二糖与D-半乳糖之间也存在强相关性，表明它们在代谢物合成、运输及其他代谢功能方面具有密切联系。
图10.代谢物共定位分析的空间分布。本图展示了目标代谢物及皮尔逊相关性排名前9的代谢物的空间分布。图中不同颜色代表物质在该区域的相对强度，代谢物含量从0到1逐渐增加。我们分析了通过MALDI-MSI鉴定的其他代谢物（主要为糖类、生物碱和类黄酮），结果如图11所示。分析表明，铁皮石斛茎中D-半乳糖（m/z 203.0529）和半乳糖基-β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖（m/z 366.1098）的含量随生长年限增加而上升。海帕乌头碱（m/z 616.2655）和麦角新碱（m/z 548.2440）在铁皮石斛茎中呈现较一致的分布模式，且在这些样本中浓度较高。新夏佛塔苷（m/z 547.2362）和芍药素-3-(6″-对香豆酰葡萄糖苷)（m/z 609.2739）在铁皮石斛茎中被检测到，二者均分布于维管束区域且随生长年限增加而积累。新夏佛塔苷和芍药素-3-(6″-对香豆酰葡萄糖苷)集中分布于铁皮石斛茎组织中，且含量逐年增加。淫羊藿苷（m/z 677.4615）在一年生、二年生及三年生茎样本的维管束中均有分布，其含量在二年生茎中最高，三年生茎中最低。
图11.铁皮石斛茎组织切片中逐年检测化合物的可视化分布。图中比例尺为1mm。
本研究通过MALDI-MSI结合多种验证手段，系统分析了一至三年生铁皮石斛茎的生理指标及代谢物空间分布。
1.生理层面：总生物碱无显著年限差异，总多糖二年生最高、三年生略降，总黄酮随年限显著上升；
2.代谢物鉴定与分布：共鉴定1039种代谢物，糖类均匀分布，生物碱富集于维管束，类黄酮集中在表皮和维管束；
3.应用价值：明确三年生为较优采收期，揭示了活性成分的组织特异性分布，为铁皮石斛的品质优化、资源高效利用及后续代谢合成机制研究提供了理论基础和方法参考。