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文献分享丨安徽农大、华中农大联合新西兰皇家植物与食品研究所揭示了猕猴桃内外果肉的差异化褪绿机制
2025-09-08
文献分享丨安徽农大、华中农大联合新西兰皇家植物与食品研究所揭示了猕猴桃内外果肉的差异化褪绿机制

英文题目：Spatial regulation of chlorophyll degradation in kiwifruit: AcNAC2-AcSGR1/2 cascades mediate rapid de-greening in the inner pericarp

中文题目：猕猴桃叶绿素降解的空间调控：AcNAC2-AcSGR1/2级联调控内果皮快速脱绿

期刊名称：Plant Biotechnology Journal

影响因子：10.5

作者单位：安徽农业大学园艺学院、华中农业大学园艺林学学院、新西兰皇家植物与食品研究所

DOI：https://doi.org/10.1111/pbi.70071

研究背景

猕猴桃以其丰富的营养和独特的风味深受消费者喜爱。目前商业栽培的猕猴桃根据其果肉颜色的不同，主要可分为绿肉品种和黄肉品种（包括黄肉红心），其中黄肉猕猴桃具有更高的经济价值。但是黄肉猕猴桃在成熟过程中常出现果实褪绿不足而产生“黄肉不黄”现象，严重影响果实品质和消费者体验。然而，这个现象背后的机制并不清晰。中华猕猴桃‘红阳’是我国主栽的黄肉红心品种，其内外果肉在果实发育过程中呈现明显的色泽分化：内果肉逐渐显现红色，外果肉同步发生明显的褪绿现象，可以更好地了解不同果实组织层间差异降解叶绿素的复杂过程。在“红阳”猕猴桃中，这些不同的组织层容易分离，采用时空动态比较分析策略，系统解析猕猴桃不同果肉组织叶绿素代谢差异。结合代谢物分析和基因表达分析，应用加权基因共表达网络分析（WGCNA）结合分子生物学手段，鉴定出调控猕猴桃内外果肉差异褪绿的关键转录因子AcNAC2，并利用多种分子手段验证其与叶绿素降解基因AcSGR1/2的调控关系。进一步利用猕猴桃稳定过表达和CRISPR/Cas9基因编辑技术，阐明了NAC转录因子通过组织特异性诱导SGR基因表达，介导叶绿素差异降解的分子机制，为猕猴桃色泽品质改良和快速褪绿猕猴桃种质资源选育提供了重要理论依据和关键分子靶标。

研究路线

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研究结果

01

“红阳”猕猴桃内外果皮色素差异的研究

“红阳”猕猴桃在果实发育过程中，内、外果皮的果肉颜色有明显的视觉差异，内果皮逐渐呈现红色，外果皮逐渐褪色（图1a）。观察授粉后周数（WAP）可以看出，花青素在内部果皮中的积累导致从授粉后约10周起淡白色果核周围出现可见的红色。外果皮在发育过程中逐渐变成黄绿色（图1a）。从8WAP开始，“红阳”果实内外果皮的叶绿素含量、类胡萝卜素含量和叶绿素/类胡萝卜素比值均表现出显著差异（图1b）。内果皮的叶绿素在果实发育过程中几乎呈线性下降，从6WAP时的25.5μg∙g-1FW下降到22WAP时的6.6lμg∙g-1FW。外果皮叶绿素含量在第8周达到最高值，随后下降到15.2μg∙g-1FW。内果皮类胡萝卜素含量从6WAP时的8.2μg∙g-1FW降至22WAP时的5.7μg∙g-1FW，外果皮的类胡萝卜素含量降至6.6μg∙g-1FW。因此，叶绿素的减少导致了外果皮果肉颜色的脱绿，而叶绿素的降解与内果皮花青苷的积累共同导致了“红阳”猕猴桃内外果皮色素的差异。

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图1.“红阳”猕猴桃果实发育过程中果肉颜色和色素的变化。（a）中华猕猴桃“红阳”6个发育期[授粉后6、8、10、14、18和22周]的肉色表现。采集了两个不同的果肉区域(内果皮和外果皮）。标尺：1cm。（b）“红阳”猕猴桃发育过程中内外果皮中叶绿素、类胡萝卜素及类胡萝卜素/类胡萝卜素比值的变化。误差线代表三个生物学重复的标准误差。黑色星号表示同一发育阶段内外果皮的显著差异（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

02

“红阳”猕猴桃叶绿素代谢相关基因的鉴定

为了找出导致“红阳”猕猴桃内外果皮色素积累差异的候选基因，对15个样品进行了转录组测序——全果在6WAP，内外果皮在8WAP和10WAP。8WAP时，外果皮和内果皮之间共发现1125个DEGS，上调935个，下调190个；10WAP时，外果皮和内果皮之间之间，共发现1498个差异表达基因（DEGs），其中1291个上调，207个下调。在这两个时间点上，大多数差异表达基因（80%）在内果皮中的表达高于在外果皮中的表达。在之前的研究中，我们研究了“红阳”果实中参与花青素代谢的基因。脱绿过程是鲜艳果肉红色形成的先决条件，因此我们在本研究中重点研究了内外果皮中叶绿素的生物合成和分解代谢的差异。根据转录组的注释，鉴定出46个与叶绿素代谢有关的叶绿素生物合成基因（CBGs）和21个与叶绿素代谢有关的叶绿素分解代谢基因（CCGs）。差异表达分析表明，无论是在8WAP还是10WAP，内外果皮之间的CBG都没有显著差异。在CCG中，编码MDCase（脱镁螯合酶-叶绿素降解酶关键酶）的AcSGR1（Acc19958）和AcSGR2（Acc28873）在8WAP和10WAP（8W_INNER和10W_INNER）时在内果皮中的表达分别高于外果皮（8W_OUTER和10W_OUTER）（图2）。

RT-qPCR结果表明，在果实发育过程中，SGR基因AcSGR1（Acc19958）和AcSGR2（Acc28873）在内果皮中的表达早于在外果皮中的表达（图3a）。MDCase活性在内果皮和外果皮之间存在显著差异，特别是在发育的中后期（从10WAP）到22WAP）（图3b）。通过在烟草叶片中瞬时过表达GFP融合蛋白进行的亚细胞定位表明，AcSGR1和AcSGR2都位于细胞的叶绿体、细胞膜、细胞质和细胞核中（图3c）。综上所述，基于基因表达和MDCase活性的结果，从果实发育的早期开始，内果皮的叶绿素降解比外果皮的更活跃。

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图2.参与叶绿素降解途径的叶绿素分解代谢基因（CCGs）的表达分析。对内、外果皮三个发育阶段(6、8、10WAP)的果肉样品进行了转录组测序和分析。热图来自RNA-seq数据的三个重复的平均FPKM值。两个候选AcSGR1（Acc19958）和AcSGR2（Acc28873）的内外果皮差异显著，用红星突出标记。

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图3. SGR基因分析。（a）“红阳”猕猴桃发育过程中SGR基因家族在内外果皮中的表达分析。（b）“红阳”猕猴桃发育过程中内外果皮中的脱镁螯合酶（MDCase）活性。黑色星号代表同一发育阶段内果皮和外果皮之间的显著差异（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。（c）AcSGR1和AcSGR2在带有核定位mCherry信号的烟草叶片中的亚细胞定位分析。位于细胞核的mCherry信号显示为红色，叶绿素自发荧光显示为玫瑰红，GFP荧光信号显示为绿色；这三者的重叠也显示（合并）。在亮场中显示细胞的完整性。标尺：20μm。

03

筛选调控AcSGR1和AcSGR2差异表达的候选转录因子

为了进一步探索SGR的上游调控因子，从15个样本的RNA-seq结果中，表达量FPKM≥1的基因通过WGCNA与AcSGR1和AcSGR2相关联。（图4a）共聚类26个共表达模块，其中‘pink’模块与AcSGR1（r=0.92，p=1E-06）和AcSGR2（r=0.97，p=2E-09）表达相关性最高（图4a）。在GS-MM分析的基础上，从含有311个与S1和S2相同的基因的粉红模块中进一步筛选出满足阈值的327个（S1）和433个（S2）基因（图4b）。该模块包含几个NAC转录因子，如AcNAC2、AcNAC3和AcNAC4(分别为Acc26399、Acc21700和Acc08288)，这些转录因子先前参与了猕猴桃果实的其它各种过程的正向调控，如萜类生物合成、乙烯生物合成、香气生物合成和果实软化，而先前研究的黄色肉质猕猴桃脱绿调节因子AcHZP45（Acc09342）在果皮内外8WAP和10WAP处均未发现差异表达。

根据FDR<0.01、|Log2FC|>1和FPKM>5的条件进一步提炼出311个共同基因的列表（图4b）。在得到的127个DEG中，9个差异表达转录因子（DETFs）被确定为调控AcSGR1和AcSGR2的候选基因（图4c）。基于RNA-seq数据分析表明，所有9个DETFs在8WAP或10WAP时在内外果皮之间显示出显著的差异表达。

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图4.筛选调控AcSGR1和AcSGR2差异表达的候选DETFs。（a）模块与性状之间的关系(AcSGR1和AcSGR2)。粉红色模块与AcSGR1和AcSGR2的相关性最高，用红星突出显示，并选择用于进一步分析。（b）基于对AcSGR1和AcSGR2的基因重要性（GS）-模块成员(MM)分析，从‘pink’模块中筛选共同的DEGs。根据‘|MM in pink module|>0.8’和‘|GS for AcSGR1|>0.8’的阈值筛选‘S1’和‘S2’集合中的基因，其中包含311个与AcSGR1和AcSGR2相同的基因。通过设置Log2FC、FPKM和FDR作为阈值，进一步识别出127个常见的DEGs。（c）从127个共同的DEGs中确定了9个候选DETFs，它们与AcSGR1和AcSGR2都显示出高相关性。

04

AcNAC2正调控AcSGR1和AcSGR2基因的表达

通过双荧光素酶活性检测来评估DETFs对9个候选调节子的AcSGR1和AcSGR2启动子活性的调节作用。Acc26260（一种含有LOB结构域的蛋白）对AcSGR1和AcSGR2的启动子缺乏活性，没有表现出明显的调控作用，因此分析了其他8个DETFs。结果表明，AcNAC2作为AcSGR1和AcSGR2启动子的共同激活剂，启动子活性分别提高了2.7倍和3.5倍（图5a）。Acc13705只对AcSGR1启动子有微弱的激活作用，而Acc23626和Acc04591分别对AcSGR1和AcSGR2启动子有一定的抑制作用。用RT-qPCR检测AcNAC2的转录丰度，结果表明，从8WAP开始，AcNAC2在果实发育过程中内果皮的表达显著高于外果皮（图5b）。AcNAC2在内侧果皮中的表达早于8WAP，而在外侧果皮中的表达在18WAP时急剧增加。亚细胞定位显示AcNAC2位于细胞核中，可能位于细胞质中（图5c）。

从大肠杆菌中表达和纯化了重组AcNAC2-GST蛋白，并进行了凝胶迁移率改变分析（EMSA），以进一步验证AcNAC2与AcSGR1和AcSGR2启动子的相互作用（图5d）。[TA]NN[CT][TCG]TNNNNNNA[AC]GN[ACT][AT]基序已被预测为NAC家族成员的核心顺式调控元件，并且也存在于AcSGR1和AcSGR2启动子中（图5d）。凝胶迁移率改变分析（EMSA）表明，AcNAC2能与AcSGR1和AcSGR2启动子中的核心顺式元件物理结合，其顺式元件分别位于AcSGR1启动子ATG上游434~406和AcSGR2启动子上游536和508之间（图5d）。随着冷探针浓度的增加，结合作用逐渐减少。综上所述，这些结果表明AcNAC2直接与AcSGR1和AcSGR2的启动子相互作用并激活其表达。

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图5.AcNAC2正向调节AcSGR1和AcSGR2基因的表达。（a）DETF对AcSGR1和AcSGR2启动子的调控作用。空载体（SK）加启动子中的Luc/Ren比值归一化为1。Luc/Ren比值大于2被认为是正调控（条带呈红色）。（b）AcNAC2在“红阳”猕猴桃发育过程中内外果皮中的表达分析。（c）AcNAC2在烟草叶片中的亚细胞定位，带有核定位的mCherry信号。位于细胞核的mCherry信号和GFP荧光信号分别以红色和绿色显示，两者也有重叠（合并），而明亮的视野表示细胞的完整性。标尺：20μm。（d）经EMSA证实，AcNAC2与AcSGR1/2启动子直接结合。带有NaCS核心结合元件的寡核苷酸（[Tf，[TA]NN[CT][TCG]TNNNNNNNA[AC]GN[ACT][AT]）以粗体显示并用于EMSA。使用的浓度是相应的标记探针的500倍（+）和1000倍（++）。误差线表示三次重复实验的标准误差（*P>0.05、**P>0.01)。

05

AcNAC3正调控AcSGR1和AcSGR2基因的表达

对猕猴桃NAC转录家族进行了系统发育分析，并与拟南芥、番茄、香蕉和荔枝衰老相关的NAC家族成员进行了比较。猕猴桃共有147个NAC成员，可分为六个主要亚组（编号为I至VI）。分析表明，AcNAC2与AcNAC3具有最高的序列同源性，两个NAC基因都与番茄的SlNOR和SlNOR-like1基因聚在一起。

“AcNAC3在10W_outer vs 10W_inner”组的FDR水平超过0.01（FDR=0.0102），不满足FDR<0.01，|Log2FC|>1和FPKM>5的差异转录因子的筛选条件。然而，由于其与AcNAC2的高度序列同源性，并且在pink模块中同时存在AcNAC2和AcNAC3(Acc26399和Acc21700)，使用双荧光素酶测定将AcNAC3对AcSGR1和AcSGR2启动子的调节作用与AcNAC2进行比较。结果表明，AcNAC3对AcSGR1和AcSGR2启动子有微弱的激活作用，但激活程度（1.6倍和1.5倍）低于AcNAC2（2.7倍和3.5倍，图5a）。这些结果表明，NAC基因家族成员参与了SGR基因表达的变化，其中AcNAC2可能起到比AcNAC3更强的激活作用。

06

AcNAC2和AcNAC3促进叶绿素降解的功能验证

为了进一步研究AcNAC2和AcNAC3在烟草中的功能，我们在烟草中瞬时过表达了AcNAC2和AcNAC3（PHEX2AcNAC2和3）。7天后，与对照（PHEX2-GUS）相比，AcNAC2表现出强烈的可见烟叶脱绿表型。与对照相比，叶绿素含量显著降低。相反，与AcNAC2（pHEX2-AcNAC）相比，瞬时过表达AcNAC3（pHEX2-AcNAC3）所介导的烟叶视觉脱绿不那么明显。观察到的较弱的AcNAC3表型与用双荧光素酶分析观察到的较弱的启动子激活一致（图5a）。总体而言，与AcNAC3相比，在烟草中瞬时过表达AcNAC2引起的脱绿效应一般更强，因为视觉脱绿效应也可以比AcNAC3更早观察到（AcNAC2的第4-5天），而AcNAC3在第7天就明显观测到。

为了进一步研究NACs在猕猴桃脱绿中的作用，利用3SS CaMV启动子驱动的AcNAC2（AcNAC2::pSAK277）基因在猕猴桃“东红”中进行了稳定转化。获得了三个独立的转化系（35S::AcNAC2#23，#43，#45），它们都表现出严重的叶片黄化（图6a）。由于获得的样本量有限，优先进行RT-qPCR检测，证实了AcNAC2转录本表达了，与野生型（WT）株系中的表达相比，在三个转基因株系中的成功积累（>1000倍）（图6b）。AcNAC2的下游靶基因AcSGR1和AcSGR2在所有三个转基因株系（35S::AcNAC2#23，#43，#45）中的转录水平显著高于野生型，AcSGR1分别上调17.5倍、8.8倍和8.1倍，AcSGR2分别上调9.1倍、11.2倍和16.2倍（图6c，d）。这些结果支持这样的假设，即AcNAC2是植物中AcSGR1和AcSGR2的直接激活剂，可能在促进果实的叶绿素降解方面发挥作用。

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图6.AcNAC2在猕猴桃（中华猕猴桃“东红”）植物中的稳定过表达。（a）野生型（WT）和过表达AcNAC2的三个独立转基因系（35S::AcNAC2#23，#43，#45）的视觉外观。标尺：1cm。（b-d）WT和三个转基因系中AcNAC2，AcSGR1和AcSGR2的mRNA表达量。（b-d）中的误差线表示三次重复实验的标准误差。进行双尾t检验用于统计分析，WT和三个转基因系之间的显著差异用黑色星号表示（***P<0.001）。

经过长时间的继代培养，35S::AcNAC2高表达系的黄化表型被证明是致命的，无法获得可用于转移到温室以获取果实的生根植株。因此，为了研究AcNAC2和AcNAC3在水果脱绿中的作用，采用CRISPR-Cas9技术以获得敲除两个NAC基因的突变植株。在一种自花授粉、雌雄同株的中华猕猴桃品系中产生转化体，该品系在转化后6个月内开花，且果实较小（15-20克，直径20毫米），表现出典型的成熟过程。获得了两个品系（#173和#180），它们在AcNAC2和AcNAC3的开放阅读框中均显示出多处移码突变（图7a、b），表明它们是两个NAC基因的双等位基因突变体。这些品系被命名为“nac2nac3”突变体。

对果实进行详细的表型分析nac2nac3品系#173和#180以及处于四个发育阶段（13、18、23和26WAP）的WT（图7c）。来自WT和双突变系的水果体积较小，因此不能解剖不同的组织，因此在所有时间点都对整个水果进行采样。结果表明，两个nac2nac3突变系的果肉脱绿明显延迟，果实比WT至少晚5周进入黄肉期（图7c）。与WT果实相比，从18WAP开始的两个转基因系的色调角度（图7d）和叶绿素含量（图7e）都显著增加。这些变化也与转基因猕猴桃中AcNAC2和AcNAC3的表达水平显著下降相对应（图7f）。

RT-qPCR检测NAC靶基因AcSGR1和AcSGR2的转录水平。在两个叶绿素含量增加的品系中，在果实发育过程中，与WT相比，在所有四个时间点，nac2nac3突变体的AcSGR1和AcSGR2的表达都显著降低（图7g）。这些结果进一步证实了这样的观点，即AcNAC2可能与AcNAC3结合，通过协调AcSGR1和AcSGR2的表达来调节猕猴桃的叶绿素降解。

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图7.nac2nac3双等位基因突变体显示了果实中叶绿素的延迟降解。（a，b）AcNAC2和AcNAC3基因组序列中的四个靶点（g1-g4）示意图和nac2nac3突变体#173和#180系中编辑位点的Hi-Tom平台测序。外显子用绿色方框表示，sgRNA位置用橙色箭头表示。基因特异的引物结合部位用箭头表示。SgRNA靶向序列和PAM序列分别以橙色和绿色表示。突变位置以灰色背景表示。（c）野生型(WT)和两个nac2nac3突变体品系(#173和#180)在四个发育阶段（13，18，23和26WAP）的果肉颜色变化。WAP，授粉后数周。标尺：1cm。（d，e）对nac2nac3突变系（#173和#180）和WT的四个发育阶段的色调角（d）和叶绿素含量（e）的动态分析。WT的叶绿素含量在各个时期均归一化为1。（f，g）AcNAC2和AcNAC3（f）以及靶基因AcSGR1和AcSGR2（g）在nac2nac3突变系（#173和#180）和WT中的表达。色调角度（d）的误差条代表6个生物重复的标准误差，其余的来自3个重复。星号表示WT和两个转基因品系之间存在显著差异（*P>0.05，**P>0.01，***P>0.001）。

讨论与总结

本研究聚焦“红阳”猕猴桃内、外果皮叶绿素降解差异机制，揭示AcNAC2-AcSGR1/2级联调控内果皮快速褪绿的分子机制。研究发现，“红阳”猕猴桃发育期间，内果皮叶绿素降解速度显著快于外果皮，且叶绿素/类胡萝卜素比值降幅更大，同时内果皮积累花青素形成红果肉，外果皮呈黄绿色。转录组分析显示，内果皮中AcSGR1和AcSGR2基因表达量更高，脱镁螯合酶活性也相应提升，而叶绿素合成相关基因无显著差异，表明这两个基因是叶绿素降解差异的关键。通过加权基因共表达网络分析，筛选出NAC转录因子AcNAC2。双荧光素酶实验和电泳迁移率变动分析证实，AcNAC2可直接结合AcSGR1/2启动子的核心顺式元件，显著激活其表达。同源基因AcNAC3虽也能激活，但作用较弱且表达量低。瞬时表达实验显示，AcNAC2在烟草中促进叶绿素降解；猕猴桃稳定过表达AcNAC2导致叶片严重失绿，AcSGR1/2表达大幅上调；CRISPR敲除AcNAC2/3则显著抑制AcSGR1/2表达，延缓果实褪绿。该研究通过整合生物信息学分析和分子生物学技术，结合猕猴桃遗传转化验证，系统解析了NAC-SGR关键级联通路在调控猕猴桃不同果肉组织叶绿素差异代谢的重要作用。这些研究深化了对果肉叶绿素代谢调控的认识，也为猕猴桃等特色果树的色泽品质改良和分子设计育种提供理论依据和分子靶标。
参考文献：Wu Y, Liu J, Sheng X, et al. Spatial regulation of chlorophyll degradation in kiwifruit: AcNAC2‐AcSGR1/2 cascades mediate rapid de‐greening in the inner pericarp[J]. Plant Biotechnology Journal, 2025.
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