本研究中，对突变体pir1和野生型植株接种水稻白叶枯病菌菲律宾小种6号（P6，菌株PXO99A）。结果显示，与野生型相比，突变体pir1的病斑长度显著缩短，且叶片内病原菌数量显著降低（图1a-c），表明该突变体对白叶枯病的抗性显著高于野生型。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测的4种病程相关蛋白（OsPR1a、OsPR1b、OsPR5和OsPR10）在突变体pir1中的表达量均显著高于野生型植株（图1d），说明突变体pir1具有典型的自身免疫特征。

鉴于突变体pir1对白叶枯病菌的抗性与其类病斑程度密切相关，对突变体pir1的3个不同叶位（叶a：类病斑数量多；叶b：类病斑数量少；叶c：无类病斑）的蛋白组进行比较分析，并以野生型对应叶位作为对照。通过2D-DIGE技术分离差异表达蛋白，扫描后获得重复性良好的双向荧光电泳图谱。利用DeCyder 2D 7.0软件分别分析突变体pir1和野生型ZJ22的3个叶位总蛋白的2D-DIGE图谱，设定蛋白表达丰度变化≥1.5倍且经Student's t检验p<0.05为差异显著标准，最终获得表达差异显著的蛋白点。

将考马斯亮蓝染色凝胶图谱与2D-DIGE图谱比对后，从考马斯亮蓝染色凝胶中提取差异蛋白点，通过质谱鉴定最终获得321个差异蛋白点。其中，与野生型相比，突变体pir1中显著上调的蛋白点有87个（记为M），显著下调的蛋白点有234个（记为W）。图2展示了部分已鉴定的ZJ22和pir1差异蛋白点表达丰度的三维立体图。

进一步分析发现，叶a中鉴定出20个差异表达蛋白位点，叶b和叶c分别鉴定出255个和205个差异表达蛋白位点。这种差异可能是因为突变体的第1片真叶（叶a）尚未形成类病斑表型，其形态和生理特征与野生型相似，因此该阶段差异蛋白表达量较少，仅占总定量蛋白的9.3%；而类病斑表型出现的第2片和第3片真叶（叶b和叶c）差异蛋白表达量最高，分别占总蛋白的79.4%和63.8%。值得注意的是，有139个蛋白仅在第2片和第3片真叶中差异表达，而在第1片真叶中无差异表达，这些蛋白可能是突变体pir1触发PCD并诱导抗病反应的关键调控因子。

对差异表达蛋白分别进行基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。GO富集分析结果显示，在“生物学过程”类别中，“光呼吸”（GO：0009853）、“还原戊糖磷酸循环”（GO：0019253）和“质子转运偶联ATP合成”（GO：0015986）是显著富集的条目，分别包含84个、73个和50个蛋白（图3a）；在“分子功能”类别中，“ATP结合”（GO：0005524）、“镁离子结合”（GO：0000287）和“核酮糖二磷酸羧化酶活性”（GO：0016984）富集程度最高，其次是“单加氧酶活性”（GO：0004497）和“核苷酸结合”（GO：0000166）（图3a）；在“细胞组分”类别中，大多数蛋白定位于“质体”（GO：0009536）、“叶绿体”（GO：0009507）和“叶绿体类囊体膜”（GO：0009535）（图3a）。

KEGG通路富集分析结果显示，差异表达蛋白主要富集于以下通路：代谢途径（KO01100）、碳代谢（KO01200）、光合生物中的碳固定（KO00710）、次生代谢物生物合成（KO01110）以及乙醛酸和二羧酸代谢（KO00630）（图3b）。

利用NCBI、Uniprot和RGAP等生物信息学数据库对差异表达蛋白进行功能分析，结果显示这些蛋白参与光合作用、能量代谢、防御反应、糖代谢等多种生物学过程（图3c-3e）。功能分析表明，差异表达蛋白中占比最高的是光合作用相关蛋白（38.01%），其次是碳水化合物代谢和能量代谢相关蛋白（15.89%），而氧化还原相关蛋白占比最低（4.98%）（图3c）。此外，对上调和下调蛋白分别进行功能分析发现，两类蛋白均主要富集于光合途径，分别占各自类别蛋白的45.98%和35.04%（图3d、3e），这表明突变体pir1的光合作用受到严重抑制。同时，上调蛋白中防御反应相关蛋白占比显著（21.84%）（图3d），提示突变体pir1中抗病及防御反应被激活；而下调蛋白中碳水化合物代谢和能量代谢相关蛋白占比较高，分别为20.09%和18.80%（图3e），这与突变体pir1表现出的育性差等农艺性状特征一致。

通过qRT-PCR分析差异表达蛋白在mRNA水平的变化（图4），该图直观展示了mRNA与蛋白水平的相关性。在选择用于qRT-PCR验证的基因时，重点关注本研究中关键通路（如氧化还原、碳水化合物代谢、能量代谢、光合作用和防御反应）中的差异表达蛋白。此外，这些差异表达蛋白在之前突变体pir1与野生型的转录组比较中也表现出转录水平的差异，表明这些基因在转录和翻译后水平的表达具有高度一致性。通过这种相关性分析方法，可探究突变体pir1中转录组与蛋白组变化的一致性。从ZJ22和pir1的叶a、叶b、叶c中提取总mRNA，结果显示绝大多数差异表达蛋白与其对应mRNA水平呈强相关性。具体而言，以下蛋白的mRNA水平与其蛋白丰度变化高度相关：谷胱甘肽S-转移酶（MA1B1C1）、抗坏血酸过氧化物酶（MB18C18）、锰超氧化物歧化酶（MB20C20）、乙醇酸氧化酶（WB86C86）、异黄酮还原酶（MC1）、ATP合酶β亚基（MB9C9）、核苷二磷酸激酶（MB22C22）、翻译延伸因子（WB43）、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基（Rubisco LSU，WA1B1C1）、光系统II放氧复合体蛋白（WB45）、放氧增强蛋白（WB39C39）、病程相关蛋白（MA2B2C2）、14-3-3样蛋白（MB11）、病程相关蛋白（MB17C17）、叶绿体伴侣蛋白（WB3）、无机焦磷酸酶（WB111C111）、铁蛋白（MC24）以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（MB1C1）。相反，14-3-3样蛋白（MB33）和过氧化物酶（MA1）在突变体pir1中的mRNA水平与其蛋白水平相关性较弱。

过氧化物酶及其他参与高代谢周转和自我复制的酶可通过脂肪酸β-氧化产生ROS作为副产物。ROS不仅可作为抗菌剂，还可作为调控抗病反应的信号分子。本研究中观察到氧化还原相关蛋白显著富集，因此推测突变体pir1中关键抗氧化酶（如超氧化物歧化酶SOD、抗坏血酸过氧化物酶APX和过氧化物酶POD）的水平可能发生显著变化，进而导致ROS积累。基于此，本研究对野生型（WT）和突变体pir1中相关胁迫标志物的水平进行了定量分析。

如图5所示，与野生型相比，突变体pir1中过氧化氢（H₂O₂）、超氧阴离子（O₂^-）、丙二醛（MDA）和脯氨酸的水平显著升高。ROS的积累似乎可触发PCD，从而在抗病反应中发挥正向调控作用。突变体pir1中SOD和POD活性均显著升高，这些结果与转录和翻译水平的数据基本一致。

SOD可催化O₂^-歧化为H₂O₂，因此观察到的SOD活性升高可能是突变体pir1中H₂O₂积累量增加的原因之一。相反，与野生型相比，突变体中CAT活性显著降低，这表明突变体清除H₂O₂的能力严重受损，进而加剧ROS的积累。

此外，野生型中可溶性蛋白和可溶性糖含量高于突变体pir1，这提示突变体受到ROS诱导的胁迫，可能导致碳水化合物分解代谢不足。这种代谢缺陷可能会影响细胞生命活动所需的能量代谢，进而导致突变体出现矮化和不育表型。

在分蘖期，取野生型和突变体叶片中部进行横切，通过TEM观察细胞结构（图7）。结果显示，野生型植株叶片细胞中细胞质分布均匀，叶绿体基粒类囊体排列整齐，整体细胞结构完整；而突变体pir1的细胞结构严重受损，细胞显著皱缩并发生强烈质壁分离。尽管细胞壁相对完整，但出现局部增厚且结构疏松；质膜与细胞壁分离，并出现内陷和囊泡化；细胞质基质稀薄呈水样，含有大量不规则液泡；叶绿体被膜大部分破裂，类囊体系统完全解体为碎片，基质区空泡化，基粒类囊体排列紊乱且断裂；线粒体嵴模糊且数量减少；中央液泡体积缩小，膜结构褶皱。

图7.野生型（WT）与突变体pir1的细胞结构。（a，b）野生型中部区域的细胞结构；（c，d）突变体pir1中部区域的细胞结构。

本研究证实，突变体pir1对水稻白叶枯病菌（Xoo）表现出强抗性。蛋白组学分析显示，突变体pir1中与光合作用、碳水化合物代谢及能量代谢相关的蛋白表达下调，而防御相关蛋白表达上调。与此同时，与野生型相比，突变体pir1的关键光合参数显著降低，表明其光合效率下降。这种光能利用能力的受损可能导致过剩激发能的产生，进而触发活性氧（ROS）积累，并可能诱导程序性细胞死亡（PCD）（图8）。此外，突变体pir1中防御相关蛋白的上调表达可能促进细胞凋亡过程，最终使其对白叶枯病的抗性显著提升。

图8.pir1在蛋白质水平上触发程序性细胞死亡（PCD）的分子模式。每个条形图代表一种蛋白质，条形图左侧代表旗叶，中间代表第二叶，右侧代表第三叶，红色表示上调，绿色表示下调，黑色表示无变化。