在150mM NaCl和Na₂SO₄处理9天后，长穗偃麦草幼苗表现出显著差异的表型变化：Na₂SO₄处理导致根系生长受强烈抑制，根长较对照组缩短24.5%，根干重下降21.3%，同时叶片严重萎蔫、叶尖黄化且边缘焦枯，叶片相对含水量（RWC）3天内下降18.2%；而NaCl处理对根系抑制较弱（根长减少12.6%），叶片损伤也较轻。这一表型差异与后续生理指标（如Na₂SO₄处理下MDA含量升高、Ca²⁺吸收受阻）及转录组分析中“离子跨膜运输”通路的显著富集一致，表明SO₄^2-通过诱导氧化应激和离子失衡对植物生长产生特异性抑制作用。

盐胁迫显著改变了长穗偃麦草的生理指标和离子分布：图2表明，Na₂SO₄处理导致叶片和根系中丙二醛（MDA）含量在3天内急剧升高（叶片MDA增幅达2.3倍，根系1.8倍），且Na₂SO₄的氧化损伤效应强于NaCl，这与图3中脯氨酸（Pro）在根系中的大量积累（Na₂SO₄组Pro含量为对照组的3.7倍）共同反映植物通过渗透调节和抗氧化系统应对盐胁迫；图4进一步揭示，Na₂SO₄处理显著抑制超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性（处理9天后SOD活性下降42%，POD活性上升58%），而NaCl处理下SOD活性仅在初期短暂升高后趋于稳定，表明SO₄^2-对活性氧（ROS）清除系统的破坏更持久；图5的离子检测显示，Na₂SO₄处理使叶片和根系Na⁺浓度分别增加2.1倍和3.3倍，同时根系Ca²⁺吸收受阻（Ca²⁺含量下降36.7%），而NaCl处理下Ca²⁺水平无显著变化，揭示SO₄^2-通过干扰Ca²⁺信号通路加剧离子失衡，这一结果与转录组中“离子稳态”和“氧化还原平衡”通路的富集（图7C）相呼应，阐明了SO₄^2-特异性毒性导致氧化损伤和离子毒性的分子机制。

图3.NaCl和Na₂SO₄胁迫对长穗偃麦草叶片和根系中丙二醛（MDA，图A、B）及脯氨酸（Pro，图C、D）含量的影响，图中顶部垂直条表示各处理组在每天处理中的LSD值（p<0.05）。

图4.NaCl和Na₂SO₄胁迫对长穗偃麦草叶片和根系中超氧化物歧化酶（SOD，图A、B）、过氧化物酶（POD，图C、D）及过氧化氢酶（CAT，图E、F）活性的影响，图中顶部垂直条表示各处理组在每天处理中的LSD值（p<0.05）。

图5. NaCl和Na₂SO₄胁迫对长穗偃麦草叶片和根系中Na²⁺（图A）、K⁺（图B）、Ca²⁺（图C）Mg²⁺（图D）Fe³⁺（图E）及Cu²⁺（图F）含量的影响，图中顶部垂直条表示各处理组在每天处理中的LSD值（p<0.05）；大写字母表示叶片间的显著差异，小写字母表示根系间的显著差异。

揭示了盐胁迫下长穗偃麦草的转录组调控网络及关键差异基因：图6通过转录组分析显示，Na₂SO₄处理诱导叶片和根系中分别产生1682个和2816个差异表达基因（DEGs），其中210个基因在两者中共同响应，GO富集分析表明这些DEGs主要参与“氧化还原稳态”（如过氧化物酶活性相关基因）、“离子平衡”（如Ca²⁺/H⁺反向转运体CAX5）和“信号转导”（如蛋白激酶CDPK6）等通路；图7进一步通过转录因子（TF）家族分析发现，Na₂SO₄处理显著激活NAC、MYB和WRKY等家族的转录因子（如叶片中46个TFs上调，根系中69个TFs上调），同时抑制乙烯（ETH）信号通路相关基因（如ACC合成酶ACS1/ACS2），但上调水杨酸（SA）信号通路基因（如NAMT1），表明植物通过协调NAC/MYB/WRKY转录因子网络与SA/ETH激素信号，结合Ca²⁺信号通路（如CP1蛋白与CDPK1互作调控Ca²⁺信号转导），系统性响应Na₂SO₄胁迫；此外，蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络预测显示，候选基因CAX5（编码液泡膜Ca²⁺/H⁺反向转运体）与CCX1-5等H⁺依赖性K⁺/Na⁺转运体存在互作，而CP1可能通过与KIN14E结合负调控根系生长，进一步支持离子转运与信号转导的协同调控机制。

图7.转录调控相关DEGs中转录因子（TF）基因的数量：(A)叶片中注释的差异表达转录因子（DETs）；(B)根系中注释的DETs。

揭示了盐胁迫下长穗偃麦草的基因表达动态与代谢通路调控特征：图8通过基因集富集分析（GSEA）显示，Na₂SO₄处理显著抑制了根系中与“氧化还原稳态”相关的基因集（如过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶基因），其标准化富集分数（NES）为-2.1，表明ROS清除系统功能受损；同时，叶片中“硫同化”（GO：0000103）和“硫酸腺苷酰转移酶活性”（GO：0004779）通路被特异性激活（NES>1.8），反映植物通过增强硫代谢应对SO₄^2-毒性。图9进一步通过代谢通路关联分析发现，SA信号通路关键基因（如UGT74F2）在叶片中上调表达，其编码的糖基转移酶可将水杨酸（SA）转化为糖基化衍生物（SGE），并通过与NAC055/NAC072转录因子互作增强抗逆性；而茉莉酸（JA）信号通路基因（如T4E14.7）在根系中显著下调，导致JA介导的根系生长抑制被缓解，这一结果与PPI网络预测的CP1蛋白负调控根系发育相一致，共同阐明植物通过SA-JA信号拮抗与硫代谢重编程协同抵御盐胁迫的分子策略。

图9.茉莉酸（JA）信号通路中差异基因的通路分析及蛋白质调控网络预测结果，具体包括：（A）叶片JA信号通路差异基因的调控通路；（B）叶片JA信号通路差异基因的蛋白质调控网络预测；（C）根系JA信号通路差异基因的调控通路；（D）根系JA信号通路差异基因的蛋白质调控网络预测。

本研究揭示了Na₂SO₄胁迫下长穗偃麦草中四个候选Ca²⁺信号通路基因（PXG2、CAX5、BON3、CP1）的蛋白质互作网络及其潜在功能：分析显示，液泡膜Ca²⁺/H⁺反向转运体CAX5通过H⁺-ATPase和H⁺-焦磷酸酶建立的质子梯度驱动Ca²⁺螯合，其预测的互作蛋白CCX1-5（图11A）作为H⁺依赖性K⁺/Na⁺转运体，可能协同调节细胞内离子平衡；CP1蛋白（图11D）被预测与CDPK1（钙依赖性蛋白激酶）和CAMTA3（钙调素结合转录因子）互作，参与信号转导和冷胁迫响应，同时通过Ca²⁺通道TPC1结合调控气孔开闭，其与微管骨架蛋白KIN14E的互作则暗示对根系生长的负调控作用；此外，PXG2（图11B）和BON3（图11C）分别通过与脂质代谢酶和细胞壁修饰蛋白的互作，可能参与膜稳定性和细胞膨压调节，共同构成植物应对SO₄^2-诱导的Ca²⁺信号紊乱的分子防御体系。

图11.与盐胁迫相关的钙信号通路候选基因及蛋白质调控网络预测结果。（A-D）分别代表CAX5（A）、PXG2（B）、BON3（C）和CP1（D）蛋白与蛋白的相互作用（PPI）网络。

构建了长穗偃麦草应对Na₂SO₄胁迫的分子调控模型，揭示其通过多层次信号网络实现胁迫感知与适应性防御的协同机制：当SO₄^2-进入细胞后，首先通过GIPC蛋白介导的Ca²⁺通道激活，引发细胞质内Ca²⁺浓度瞬时升高，激活的Ca²⁺信号通过SOS信号转导级联促进Na⁺外排并维持Na⁺/K⁺平衡；同时，SO₄^2-诱导的氧化应激触发SA信号通路，通过NAMT1甲基转移酶催化SA生物合成，并经NPR1/NPR3介导的蛋白降解途径激活抗氧化防御基因（如APX7）；在转录水平，NAC/MYB/WRKY转录因子家族协同调控离子转运蛋白（如CAX5）和渗透调节基因的表达，最终通过增强离子稳态、渗透平衡和抗氧化能力，使植物获得盐胁迫耐受性。

图12.长穗偃麦草对Na₂SO₄胁迫信号的感知、转导与响应的模式图。