新鲜莲子的果皮在室温下储存24小时后开始褐变，72小时后出现明显褐变（图1A）。莲子在储存期间从0到48小时的褐变速率显著加快，果皮褐变指数在0至96小时的储存期内持续上升（图1B）。与此同时，莲子硬度从0到48小时显著下降（图1C）。通过色度值L*、a*、b*、C和h°对种子果皮在储存过程中的颜色变化进行评估（图1D）。通常来说，b*、C和h°的色度值从48小时逐渐下降至96小时，而同期莲子果皮的a*值则持续上升。此外，L*值在整个采后储存期间持续降低，表明莲子果皮的颜色逐渐变暗。为探究莲子果皮在常温储存中的采后响应，研究人员分析了多项生理指标。如图1E所示，莲子果皮的相对含水量（RWC）在整个储存期间呈现显著下降趋势，从0小时的75.1%降至96小时的36.4%。在采后储存过程中，丙二醛（MDA）含量与总酚、总黄酮物质含量持续上升，而总叶绿素含量未见明显变化。此外，研究还对采后莲子果皮的木质素、纤维素及半纤维素等结构成分进行了检测。在采后储存期间，木质素和半纤维素含量分别呈现上升和下降趋势，而莲子果皮中的纤维素含量仅出现轻微变化（图1E）。此外，研究人员进一步分析了这些指标与莲子直接衰老指标之间的相关性。总酚和丙二醛（MDA）含量与莲子褐变指数呈正相关，而相对水分含量（RWC）和L*值则与褐变指数呈负相关。本研究对莲子果皮中的多种植物激素（包括脱落酸（ABA）、反式玉米素核糖苷（tZR）、生长素（IAA））以及乙烯前体物质‌1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）含量进行了检测（图1F）。结果显示，ACC含量增加，ABA和IAA水平分别在24小时和48小时显著上升。与之形成鲜明对比的是，tZR（一种细胞分裂素）的含量在采后储存期间显著下降（图1F）。

为探究莲子果皮在常温储存期间的基因表达特征，研究人员对分别在25℃低温环境下储存0、24、48、72和96小时的样本进行了RNA测序。从15个样本中共鉴定出29,488个单基因，其中包括2715个新发现的基因。为评估RNA测序数据的可重复性和相似性，我们进行了主成分分析（PCA）。散点图显示，各储存时间点三个生物学重复样本呈现紧密聚类特征（图2A）。值得注意的是，0小时与后续储存期的莲子果皮样本间存在明显差异。主成分1和主成分2分别解释了45.02%和18.27%的方差。0小时样本与后续储存期样本之间的距离分布主要与这两个主成分对齐，表明主成分1与采后储存期间的采后响应密切相关。

本研究共鉴定出13282个差异表达基因（DEGs），具体分布如下：24小时与0小时对比组包含7085个差异表达基因（上调2899个，下调4186个）；48小时与0小时对比组包含9443个差异表达基因（上调4069个，下调5374个）；72小时与0小时对比组包含9965个差异表达基因（上调4323个，下调5642个）；96小时与0小时对比组包含11081个差异表达基因（上调5061个，下调6020个）。大多数差异表达基因（DEGs）在收获后24小时呈现2-4倍的表达量变化，而许多DEGs在超过24小时的时间点上，其表达量变化幅度甚至超过4倍（图2B）。通过K-means聚类分析，四个对比组中共筛选出13282个差异表达基因（DEGs），最终形成九个特征鲜明的表达谱。其中I至IX组分别包含980、1341、709、1163、1401、1454、2522、1576和2136个差异表达基因（图2C）。特别值得注意的是，VII、VIII和IX组的差异表达基因在整个采后储存期间均呈现显著下调趋势。基于KEGG通路数据库，我们对各组差异表达基因的生物通路进行了注释分析。研究发现，代谢通路与次级代谢产物的生物合成通路在这些组别中呈现显著关联。

植物能量代谢依赖于糖酵解和三羧酸（TCA）循环中的碳水化合物分解代谢，这些过程是细胞呼吸和ATP合成的核心。在莲子采后过程中，这些途径在莲子果皮中显著激活。在糖酵解途径中，共鉴定出27个差异表达的结构基因。在这些差异表达基因中，分别有3、4、4、1、5和10个编码关键酶的基因：葡萄糖-6-磷酸异构酶（PGI）、6-磷酸果糖激酶（PFK）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、磷酸甘油酸激酶（PGK）、烯醇化酶（ENO）和丙酮酸激酶（PK）（图3A）。值得注意的是，在27个差异表达基因中，有22个在采后储存期间显著下调。类似地，编码三羧酸循环相关酶的基因也呈现相似的表达趋势。研究鉴定出四个编码柠檬酸合酶（CSY）的基因（Chr03.g11139、Chr03.g14400、Chr03.g14498、Chr04.g17080），其中Chr03.g14400、Chr03.g14498和Chr04.g17080在莲子果皮的采后储存期间持续呈现下调趋势。此外，编码线粒体丙酮酸载体（MPC）、琥珀酸脱氢酶（SDH）和琥珀酰辅酶A连接酶（SCoAL）的Chr01.g01669、Chr01.g03194和Chr03.g13108基因也表现出下调。另外，编码苹果酸酶（ME）的Chr01.g05629、Chr01.g06187和Chr08.g25719三个差异表达基因同样呈现类似的下调模式（图3A）。

氧化还原稳态在果实采后贮藏过程中对衰老具有关键调控作用。研究共鉴定出两个编码超氧化物歧化酶（SOD）的差异表达基因、两个编码过氧化氢酶（CAT）的差异表达基因、两个编码抗坏血酸过氧化物酶（APX）的差异表达基因，以及一个编码谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）的差异表达基因（图3B）。其中，编码SOD的Chr02.g09208基因、Chr01.g00063和Chr05.g18330基因在整个采后贮藏期间均呈现下调趋势。莲子表皮层表面覆盖着一层重要的表皮蜡质，这种物质在保护和保水方面起着关键作用。长链酰基辅酶A合成酶（LACS）、脂肪酰基辅酶A还原酶（FAR）和3-酮酰基辅酶A合成酶（KCS）是参与蜡质生物合成的关键酶，研究发现这些酶在莲子表皮层的表达量在采后储存期间出现下调（图3C）。在差异表达基因中，编码LACS的Chr04.g17131、Chr05.g19277和Chr05.g20077基因，以及编码FAR的Chr02.g09391和Chr06.g21640基因，在整个采后储存期间均呈现表达量下降。此外，还鉴定出15个编码KCS的差异表达基因，其中12个出现下调现象，这表明蜡质生物合成可能受到抑制。

06

植物激素反应相关的差异表达基因

果实的成熟与衰老过程与植物激素密切相关。乙烯作为关键植物激素，不仅调控果实的成熟与衰老，还会引发采后腐败现象。在植物体内，1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）合酶（ACS）和ACC氧化酶（ACO）是乙烯生物合成途径中两个关键的限速酶。本研究鉴定出两个编码ACS的差异表达基因（Chr01.g05462和Chr08.g25618）以及三个编码ACO的差异表达基因（Chr01.g01692、Chr01.g04284和Chr05.g19977）。在莲子果皮中，Chr01.g05462、Chr01.g01692和Chr01.g04284的表达水平在采后贮藏期间呈现上调趋势（图4A），且与ACC含量增加呈正相关。此外，参与乙烯信号转导通路的差异表达基因表现出多样化的表达模式。值得注意的是，编码乙烯受体（ETRs）的Chr01.g04763和Chr02.g07396基因在整个采后贮藏期间均呈现下调趋势。相比之下，编码乙烯不敏感蛋白（EINS）的Chr02.g09123和Chr02.g10385基因表达量有所上调。鉴定出二十个编码乙烯响应因子（ERFs）的差异表达基因（DEGs）。其中，Chr03.g10745、Chr03.g13035、Chr03.g13037和Chr04.g14799基因在采后储存期间整体上调，其余十四项基因则呈现整体下调趋势（图4A）。脱落酸（ABA）是参与果实成熟和果皮颜色变化的主要植物激素。本研究发现，在莲子果皮的采后储存过程中，ABA的生物合成与信号转导通路显著激活。共鉴定出11个与ABA生物合成通路相关的差异表达基因（DEGs）。这些基因包括：一个玉米黄质环氧化酶（ZEP）基因（Chr05.g18667）、两个9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）基因（Chr03.g13637和Chr04.g17888）、三个ABA缺陷型2（ABA2）基因（Chr02.g09504、Chr02.g09505和Chr02.g09966），以及五个脱落酸醛氧化酶（AAO）基因（Chr02.g09666、Chr02.g09668、Chr02.g09669、Chr02.g10466和Chr06.g22875）（图4B）。在收获后储存过程中，有九个基因呈现上调趋势。其中Chr03.g13637、Chr02.g09505、Chr02.g09666、Chr02.g09668、Chr02.g09669和Chr02.g10466等基因在整个储存周期内持续上调，而Chr05.g18667和Chr04.g17888则在储存24小时后出现上调。此外，研究还鉴定出25个与ABA信号转导通路相关的差异表达基因，包括五个编码PYR/PYL蛋白的基因、七个编码磷酸酶2C（PP2C）的基因、五个编码ABA激活的SNF1相关蛋白激酶2（SnRK2）的基因，以及八个编码AREBs/ABFs下游ABA响应转录因子的基因。值得注意的是，在莲子果皮样本中，有15个差异表达基因在整个储存周期内均保持上调表达模式（图4B）。

图4.乙烯与ABA信号通路相关基因表达模式。（A）参与乙烯生物合成及信号转导通路的差异表达基因。缩写说明：SAMS（S-腺苷-L-甲硫氨酸）；ACS（1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶）；ACO（1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶）；ETR（乙烯受体）；EIN（乙烯不敏感）；ERF（乙烯响应因子）。（B）参与ABA生物合成及信号转导通路的差异表达基因。缩写说明：ZEP（玉米黄质环氧化酶）；NCED（9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶）；ABA2（脱落酸缺陷2）；AAO（醛氧化酶）；PYR/PYL/RCAR（一类可溶性脱落酸（ABA）受体蛋白家族，介导ABA信号转导的受体）；PP2C（Clade A蛋白磷酸酶2C）；SnRK2（蔗糖非发酵1型相关蛋白激酶2）；AREB/ABFs（ABA反应元件结合蛋白/ABRE结合因子）。

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莲子果皮在采后贮藏中的转录因子

转录调控在植物生物过程中发挥着重要作用。本研究从50个转录因子家族中鉴定出793个差异表达的转录因子。其中大部分属于bHLH、MYB、ERF、乙炔、NAC、WRKY、MYB相关和bZIP家族（图5A）。此外，GO富集分析显示这些转录因子在植物激素响应相关通路中显著富集，包括脱落酸响应、乙烯响应、生长素响应、细胞分裂素响应以及茉莉酸介导的信号通路（图5B）。我们还发现，在莲子果皮的采后贮藏过程中共有407个转录因子表达上调（图5C），这些转录因子参与了多种生物过程，如植物激素响应、缺水响应和植物衰老响应（图5D）。为预测参与莲子果皮采后衰老过程的转录因子功能，研究人员对407个上调转录因子与5950个差异表达基因（DEGs）进行了共表达网络分析。该分析成功识别出多个功能模块。例如，基因Chr01.g02126（NnRD26）、Chr03.g12541（NnDAG1）、Chr06.g22430（NnMYB66）和Chr06.g22606（NnNAC96）分别与680、49、325和794个差异表达基因（r≥0.95）呈现共表达关系（图5E）。此外，多个与缺水响应相关的DEGs被发现与Chr01.g02126及Chr06.g22430基因存在共表达。与Chr01.g02126、Chr06.g22430和Chr06.g22606共表达的DEGs还与植物激素响应相关。值得注意的是，这些转录因子共表达的DEGs可能参与氧化应激反应。特别地，编码多酚氧化酶（PPOs）的两个DEGs（Chr01.g03232和Chr01.g03859）被发现与Chr06.g22606存在共表达关系。

图5.收获后储存期间差异表达转录因子（TFs）的分析。（A）差异表达转录因子的比例分布。（B）差异表达转录因子的GO分析。（C）上调转录因子热图展示。（D）上调转录因子的功能富集分析。（E）代表性转录因子共表达网络可视化呈现。

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加权基因共表达网络构建

为了进一步研究莲子果皮在采后贮藏过程中的调控机制，本研究利用WGCNA构建了本研究鉴定出的所有差异表达基因的基因共表达网络。基于基因层次聚类树状图分析，共鉴定出九个基因共表达模块（图6A）。各模块包含的基因数量介于100至8135个之间，且同一模块内的基因表现出高度关联性。值得注意的是，在采后储存96小时时，“绿色”模块中的差异表达基因显著上调（图6B），这一现象与莲子果皮在储存期间的表型变化趋势一致。此外，该模块中多个基因呈现强相关性，涉及植物激素响应、缺水适应及植物衰老调控等生物学过程。特别值得关注的是，该模块中还检测到两个过氧化物酶（PPO）基因（Chr01.g03232和Chr01.g03859）（图6C）。进一步研究发现，莲子果皮中的PPO酶活性在储存期间显著增强（图6D），这被认为是导致莲子果皮褐变的关键因素。

图6.差异表达基因特征分析与PPO基因鉴定。（A）基于WGCNA的差异表达基因共表达模块层次聚类树。（B）“绿色”模块中差异表达基因的表达模式。（C）“绿色”模块中的共表达网络。（D）莲子果皮在室温储存期间的PPO活性。数值表示均值±标准误（n=3）。统计学显著性基于单因素方差分析结合Tukey检验，P<0.05。柱状图中不同字母表示显著差异。（E）NnPPO蛋白的保守基序及（F）多序列比对。（G）不同物种PPO基因的系统发育分类。（H）莲子NnPPO蛋白的亚细胞定位分析。（I）NnPPOs表达水平热图。

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莲PPO基因的全基因组鉴定与分析

植物过氧化物酶（PPOs）是存在于植物中的铜结合金属蛋白酶，以诱导果实采后褐变而广为人知，这显著影响了它们的储存、运输和市场价值。莲基因组中含有四个PPO基因：Chr01.g02147（NnPPO1）、Chr01.g03232（NnPPO2）、Chr01.g03859（NnPPO3）和Chr05.g19130（NnPPO4）。全长蛋白的氨基酸数量介于579至610个之间，四种PPO蛋白均含有酪氨酸酶结构域、PPO1_DWL结构域和PPO1_KFDV结构域这三大保守结构域（图6E、F）。系统发育分析表明，NnPPO基因可分为两个进化支系（图6G）。亚细胞定位实验显示，这四种NnPPO蛋白主要定位于细胞质和叶绿体膜结构（图6H）。此外，表达分析表明所有NnPPO基因在莲子果皮的采后贮藏期间均呈现上调趋势，提示这些基因在莲子采后衰老过程中发挥关键作用。值得注意的是，在这些基因中，NnPPO2和NnPPO3的表达量在整个贮藏周期持续上升，并在采后96小时达到峰值（图6I）。

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PPO基因在莲子低温贮藏中的响应

低温保存法被公认为水果采后保鲜的经济高效方案。本研究发现，低温储存能有效延缓莲子果皮褐变进程（图7A）。番红固绿染色显示，室温环境下莲子果皮的硬化薄壁细胞发生木质化和角质化，导致果皮结构加速变化（图7B）。值得注意的是，与常温保存组相比，低温组果皮在植物激素信号转导、丙酮酸代谢、乙醛酸/二羧酸代谢、脂肪酸代谢及醚类脂质代谢等方面均呈现显著差异（图7C）。此外，三种过氧化物酶（PPO）基因在不同储存温度下呈现差异表达。具体而言，与室温对照组相比，莲子果皮中的NnPPO2和NnPPO3在低温（LT）条件下的表达水平显著降低（图7D）。进一步分析发现，相较于常温储存，低温储存条件下莲子果皮的丙二醛（MDA）含量（图7E）和过氧化物酶活性（图7F）均出现明显下降。综合这些结果表明，在低温储存过程中，过氧化物酶可能通过延缓莲子果皮褐变发挥重要作用。

图7.处理后新鲜莲子低温保存分析。（A）莲子果皮在4℃（低温）和25℃（室温）环境下分别储存48小时后的外观变化。（B）莲子果皮的光学显微镜图像。（C）差异表达基因的KEGG通路分析。（D）不同NnPPO基因的差异表达水平。（E）室温与低温处理后新鲜莲子果皮中的丙二醛含量。（F）过氧化物酶活性。对照组和LT组分别代表室温和低温处理的莲子样本。

图8.在室温条件下收获后储存期间新鲜莲子果皮的变化的示意图。