治疗期间，各组大鼠体重无明显变化（图1A和图B）。与正常大鼠相比，PCOS大鼠发情周期明显紊乱，表现为持续发情间期或发情期，发情期频率减少，发情期不规则。经JTW或二甲双胍治疗后，发情周期逐渐恢复正常（图1C-E）。与正常大鼠相比，PCOS大鼠卵巢形态表现为不同发育阶段卵泡数量减少，黄体减少，囊性和闭锁卵泡增多，提示排卵异常。JTW和二甲双胍（Glucphage）在不同程度上逆转了这些病理变化（图1F-H）。PCOS大鼠血清睾酮、LH（黄体生成素）水平及LH/FSH（黄体生成素/卵泡刺激素）比值较正常大鼠升高。JTW和二甲双胍对上述异常指标显示出不同程度的疗效（图1I和J）。此外，与正常大鼠相比，PCOS大鼠表现出更高的氧化应激和糖脂代谢障碍，JTW和二甲双胍治疗都能改善这一点（图1K-M）。

用转录组学方法分析CON、PCOS和JH组之间的差异表达基因（DEGs）。与对照组相比，PCOS组122个DEGs表达上调，213个DEGs表达下调，JH组218个DEGs表达上调，152个DEGs表达下调（图2A-C）。从Venn图（图2D）中识别出133个相交的DEG。在差异表达基因（DEGs）的GO富集分析中，三个最显著的通路分别是：对其他生物细胞的杀伤、细胞外空间和钙离子结合（图2E）。KEGG分析表明，卵巢类固醇生成通路具有较高的富集评分且具有统计学意义（图2F）。在所有KEGG富集的通路分类中，内分泌系统、脂代谢、内分泌和代谢性疾病以及信号转导通路涵盖了相对较多的基因（图2G）。结合JTW对血清睾酮水平的显著调节作用，我们推测JTW可能影响PCOS大鼠卵巢类固醇激素的生成。在PCOS大鼠的卵巢中，检测到CyP17a1、Cyp11a1、Hsd3b1和Star基因的表达水平升高。然而，JTW并没有改善这些基因的异常表达（图2H-O）。

睾酮的合成过程可概括为：1.促黄体生成素、胰岛素和IGF-1与相应的受体结合，促进类固醇合成相关基因在卵泡膜细胞中的表达；2.卵泡膜细胞中的胆固醇通过StAR输入到线粒体膜内层，由CYP11A1处理形成孕烯醇酮；3.孕烯醇酮由一系列类固醇合成酶处理形成睾酮。睾酮可以通过CYP19A1在颗粒细胞中进一步转化为雌二醇（图3A）。由于JTW不影响类固醇生成相关基因的表达，我们推测其对睾酮的调节作用与胆固醇含量有关。与正常大鼠相比，PCOS大鼠的卵巢胆固醇含量升高，但JTW不能逆转该现象（图3B）。进一步的检测显示，JTW改善了PCOS大鼠卵巢中线粒体胆固醇的异常水平（图3C）。因此，我们推测JTW的作用机制可能与线粒体胆固醇输入有关。然而，各组之间线粒体胆固醇输入相关蛋白（StAR、TSPO和VDAC1）的表达没有明显变化（图3D-G）。

上述发现让我们推测，JTW对线粒体胆固醇输入的调控是否源于线粒体损伤。与对照组相比，PCOS组卵巢膜细胞线粒体纵横比、面积和周长增加，并伴有线粒体肿胀和嵴破裂（图3H-K）。随后的研究显示，在PCOS组中，DRP1的磷酸化水平降低，MFN1的表达水平升高，提示线粒体动力学异常。经JTW处理后，线粒体的长径比、面积和周长减少，DRP1磷酸化上调，Mfn1表达下调，表明JTW促进线粒体分裂并抑制融合（图3M-Q）。同时，JTW可增加PCOS大鼠卵巢中的ATP含量，提示其改善了线粒体功能（图3L）。鉴于StAR的活性依赖于其在线粒体膜外膜上的定位，我们从卵巢中提取了线粒体和胞质。JTW减少了线粒体中StAR蛋白的表达，增加了胞质中StAR的表达，表明JTW抑制了StAR向线粒体的输入（图3R-T）。进一步的多重荧光成像显示，与对照组相比，PCOS组在卵泡膜细胞中StAR与OMM蛋白TOM20的共定位增强。相对于PCOS组，JL和JH组中StAR和TOM20的共定位程度降低（图3U和V）。上述结果提示，交泰丸通过调节线粒体动力学来调节StAR介导的线粒体胆固醇输入，从而改善卵巢类固醇生成。

图3.JTW通过调节线粒体动力学来调节StAR介导的线粒体胆固醇输入，从而调节卵巢类固醇的生成。（A）卵巢类固醇生成简图。（B）卵巢总胆固醇（TC）含量（n=6）。（C）卵巢线粒体TC含量（n=6）。（D-G）卵巢中StAR、TSPO和VDAC1的蛋白质印迹分析（n=4）。（H-K）对各组卵泡膜细胞进行透射电子显微镜成像，并对线粒体长径比、面积和周长进行统计学分析。比例尺：5μm和1μm（n=3）。每组共分析90-100个线粒体。（L）各组卵巢三磷酸腺苷含量（n=6）。（M-Q）免疫印迹分析卵巢组织中DRp1、P-Drp1、FIS1、OPA1和Mfn1的表达（n=4）。（R-T）免疫印迹分析卵巢胞浆和线粒体中StAR的表达（n=3）。（U和V）TOM20/StAR/DAPI在卵巢中的多重荧光染色，以及StAR和TOM20在卵泡膜细胞中的共定位分析。卵泡膜细胞位于白色虚线所选择的区域。比例尺：100μm、50μm和5μm（n=5）。

根据我们之前的报告，选择了9个参考标准用于超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱分析。鉴定出九种活性成分，其中七种来源于黄连，两种来源于肉桂（图4A）。黄连的主要活性成分为木兰花碱、黄连碱、表小檗碱、非洲防己碱、药根碱、小檗碱和巴马汀。肉桂的主要活性成分是肉桂醛和肉桂酸。根据中国国家药学标准（图4B-F）的规定，对JTW的五种成分进行了定量。测得黄连碱、表小檗碱、小檗碱、巴马汀、肉桂醛的含量分别为62.66mg/g、28.49mg/g、145.1mg/g、48.33mg/g、1.33mg/g。此外，定量方法得到了严格的验证（表1），确保了本研究质量的可控性。

表1. 成分定量及方法验证参数。

共预测JTW治疗靶点352个，筛选PCOS治疗靶点2152个。通过交叉分析（图5A和图B）获得JTW治疗多囊卵巢综合征的135个交叉靶点。GO富集分析中富集度最高的三个术语分别是信号转导、质膜和蛋白质结合（图5C）KEGG富集分析中显著性最高的三个通路为癌症通路、癌症蛋白聚糖和内分泌抵抗（图5D）。为JTW和PCOS建立了一个连接药物、化合物、靶点、途径和疾病的网络，并筛选出31个核心靶点（图5E和F）。为了进一步确定JTW的关键靶点，对JTW的预测靶点、PCOS靶点、卵巢类固醇生成靶点和线粒体动力学靶点进行了交叉分析，从而筛选出CASP3和SIRT1（图5G和H）。CASP3与细胞凋亡有关，而SIRT1与线粒体动力学调节有关。进一步的实验表明，JTW可阻止PCOS大鼠卵巢SIRT1蛋白的减少（图5I和J），这使我们推测SIRT1是JTW调节PCOS大鼠卵巢类固醇合成的关键靶点。

图5.网络药理学预测SIRT1将成为JTW治疗多囊卵巢综合征的核心靶点。（A）多囊卵巢综合征的治疗目标和JTW的预测目标之间的交叉分析。（B）交叉靶标的蛋白质相互作用网络。（C）交叉目标的GO分析。（D）KEGG分析中的前20条路径。（E）药物-化合物-目标-途径-疾病网络。（F）筛选后得到的核心交叉目标。（G）JTW、PCOS、线粒体动力学（MD）和卵巢类固醇激素生成（OS）靶标之间的交叉分析。（H）来自（G）的交叉靶标的蛋白质相互作用网络。（I和J）卵巢SIRT1蛋白免疫印迹分析（n=4）。