为探究脱落酸（ABA）对5-HT生物合成的影响，我们首先检测了ABA处理后5-HT及其相关代谢物的变化（图1a-e）。液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析显示，在ABA暴露24小时内，5-HT及其衍生物MT均显著增加（图1d、e）。进一步分析表明，色胺水平在此期间明显升高，而色氨酸水平先下降后回升（图1b、c）。这些结果提示ABA可能促进色氨酸向色胺的转化，从而增强5-HT/MT的生物合成。
为深入解析ABA调控5-HT/MT生物合成的分子机制，我们采用两种不同浓度ABA处理后24小时，对相关基因的转录表达水平进行了分析。定量PCR（qPCR）结果显示，ABA处理显著诱导了5-HT生物合成通路中的关键基因（包括TDC1、TDC3和T5H）的表达（图1f）。而直接参与MT合成的基因则未呈现一致的诱导效应。这一发现通过ABA诱导差异表达基因（DEGs）的分析得到进一步验证（图1g），证实ABA主要通过上调5-HT通路相关基因（特别是TDC1/3和T5H）来促进5-HT/MT生物合成。
图1.ABA促进5-HT生物合成。a，植物中与5-HT生物合成相关的代谢途径。b-e，对150μM ABA处理12或24小时的水稻幼苗中色氨酸（Trp）、色胺（Try）、5-羟色胺（5-HT）和褪黑素（MT）水平的定量分析。代表性色谱图（左图）显示了ABA处理前（上）和ABA处理后（下）各化合物的特征峰。f，50μM或150μM ABA处理12小时的水稻幼苗中5-HT/MT生物合成途径（TDC1/2/3和T5H）关键基因的转录表达。g，ABA诱导差异表达基因（DEGs）中5-HT生物合成途径基因的转录变化。为阐明TDC1/3和T5H基因在ABA信号响应中的转录调控机制，我们将这些靶基因约2kb的启动子区域克隆至pLacZi2μ报告载体中，并使用本实验室构建的pb42AD转录因子文库进行酵母单杂交（Y1H）筛选。初步筛选发现多个具有潜在启动子结合活性的bZIP转录因子，其中bZIP10（ABI5）对所有三个启动子区域表现出最强的结合亲和力。鉴于ABI5在ABA介导的特定代谢物生物合成中起重要作用，例如促进苹果中花青素的生物合成及增加果实中的脂肪酸含量，后续实验将重点探讨ABI5介导的转录调控对5-HT合成的功能影响。我们采用CUT&Tag技术检测ABI5蛋白并评估其与TDC1/3和T5H基因启动子的结合情况（图2a）。分析结果显示，在TDC1和TDC3启动子的2kb区域内分别存在两个T-box和两个A-box基序（图2b）。这些序列与已知的ABI5结合位点存在重叠，提示ABI5可能通过直接结合这些区域来调控其转录。此外，我们在T5H启动子上游约1kb的区域内发现了两个响应ABA的G-box基序（图2b），这些基序也可能作为ABI5的结合位点。通过电泳迁移率变动分析（EMSA）进一步验证：ABI5与这些调控基序存在特异性结合（图2c）。后续的双荧光素酶报告基因（DLR）实验表明，ABI5可作为TDC1/3和T5H基因的转录激活因子，从而在转录水平上调控这些基因的表达（图2d）。综合以上结果可知，TDC1/3和T5H对ABA的响应机制可能受ABI5的调控。
为探究植物蛋白ABI5是否参与5-HT的生物合成，我们利用CRISPR/Cas9系统构建了ABI5基因敲除突变体（CR-abi5）（图2e）。我们还开发了在玉米Ubi1启动子控制下过表达ABI5的植物（Ubi::ABI5）。通过qPCR定量分析发现，Ubi::ABI5植株中T5H和TDC1/3的转录水平显著升高（图2f）。相应地，这些植株中5-HT/MT的浓度也明显增加（图2g）。相比之下，CR-abi5突变体中ABA诱导的T5H和TDC1/3表达明显减弱。这些实验结果表明，ABI5可能参与调控水稻中5-HT的水平，进而影响ABA介导的5-HT合成。
此外，ABI5含有多个保守的磷酸化位点，包括丝氨酸残基S44和S118，这些位点是SnRK2激酶的潜在作用靶点。为探究这些残基在ABI5转录活性中的功能作用，我们将S44和S118替换为天冬氨酸。DLR检测显示，S44位点的磷酸化显著增强了ABI5的转录活性及其激活T5H和TDC1/3的能力。以上结果表明，ABI5的磷酸化状态在5-HT生物合成中具有重要作用。
图2.ABI5参与5-HT的合成。a，经CUT&Tag分析鉴定得到的部分ABI5结合基序。这些基序主要包含对应T-box（NNA/TCTTTTTN）和A-box（NAAAAAGNNN）元件的核心序列。b，在TDC1和TDC3启动子区域约2kb范围内检测到ABI5结合基序（T-box和A-box），同时在T5H启动子区域约1kb范围内鉴定出两个经典的G-box基序。c，电泳迁移率变动分析（EMSA）实验结果显示，ABI5可与TDC1、TDC3启动子中的T-box和A-box基序结合，也可与T5H启动子中的G-box基序结合。增加未标记竞争探针的浓度会显著降低ABI5与这些基序的结合能力，证实了上述相互作用的特异性。该实验独立重复三次，结果一致。d，双荧光素酶报告基因实验（DLR）显示，在水稻原生质体中ABI5对TDC1/3和T5H启动子活性的调控作用。e，野生型（WT）与CRISPR-Cas9编辑的ABI5突变体的序列比对结果。CRISPR靶序列以绿色高亮显示，PAM序列以蓝色标注。f，野生型（WT）与Ubi::ABI5过表达株系中TDC1、TDC3和T5H基因转录水平的对比。g，野生型（WT）与Ubi::ABI5过表达株系中5-HT和MT含量的对比。植物具有调节代谢产物过量积累的调控机制，从而优化生长发育。此类代谢物的积累通常会触发强烈的反馈信号，以减轻对植物发育的潜在负面影响。然而，这些机制通常不利于提高有益代谢物的产量。我们的研究结果表明，5-HT或MT的过度积累会导致相关生物合成基因的显著下调。这表明存在一种反馈调节机制，即5-HT/MT通过自身过量积累来调节其合成。值得注意的是，5-HT合成的反馈调节与TDC1/3和T5H基因的抑制相关，这两种基因在ABA处理下均被强烈诱导。这些结果表明，5-HT的反馈调节可能部分由ABA信号通路介导。
为探究5-HT对ABA信号通路的影响，我们用外源激素处理两周龄的水稻幼苗，并在处理24小时后进行了转录组测序（RNA-seq）。仅ABA处理时，我们共鉴定出7142个差异表达基因（DEGs），其中包含3615个上调基因和3527个下调基因。当幼苗经ABA与5-HT联合处理时，差异表达基因数量降至5618个，包括2422个上调基因和3196个下调基因。我们通过韦恩图分析对比了仅ABA处理与ABA+5-HT联合处理所诱导的差异表达基因，结果显示联合处理组中鉴定出的绝大多数差异表达基因（4730/5618）与仅ABA处理组的差异表达基因存在重叠（图3a）。这一发现表明，当5-HT与ABA共同施用时，差异表达基因的转录变化主要受ABA信号通路调控。
联合处理诱导的差异表达基因数量显著减少（5618/7142），其中上调基因数量的减少尤为明显（2422/3615）（图3b）。进一步分析发现，响应ABA的信号通路及其对应基因的富集程度显著降低（11/26），不过这种降低并未延伸至所有激素信号通路（图3c）。综合以上结果可知，5-HT有减弱ABA信号通路的作用。
图3.5-羟色胺（5-HT）减弱脱落酸（ABA）信号通路的作用。a，仅ABA处理和ABA与5-HT联合处理（ABA+5-HT）的水稻幼苗中差异表达基因（DEGs）重叠情况的韦恩图。b，经ABA单独处理或ABA+5-HT处理24小时后，差异倍数≥2或≤−2且错误发现率（FDR）≤0.01的差异表达基因（DEGs）数量。c，经ABA处理和ABA+5-HT处理后差异表达基因（DEGs）的KEGG通路富集分析。与仅ABA处理组相比，以红色突出显示的激素信号通路仅在ABA+5-HT联合处理组中显著富集。d-g，经ABA或ABA+5-HT处理的种子和幼苗的表型分析、萌发率及叶绿素含量检测结果。对于幼苗，处理条件为150μM ABA和100μM 5-HT，叶绿素含量在处理一周后测定（e）；对于种子，处理条件为10μM ABA和10μM 5-HT，萌发率每12小时记录一次（g），并在72小时后进行分析（f）。h-k，外源ABA处理后，野生型（WT）和Ubi::ABI5株系的种子及幼苗的表型、萌发率和叶绿素含量对比。实验重复数据以箱线图呈现，图中叠加了单个数据点（j）。
我们进一步研究了5-HT在减弱ABA信号传导中的作用，通过检测与ABA密切相关的两个生理指标：种子萌发和叶片衰老。5-HT在这两个过程中表现出与ABA相反的效果，其最佳浓度能促进种子萌发并延缓叶片衰老。具体而言，与对照组（CK）相比，10μM ABA处理显著降低了种子萌发率和叶片叶绿素含量。相反，10μM 5-HT处理的种子和叶片显示出促生长效应，其种子萌发率和叶绿素含量均显著高于CK组。进一步分析浓度依赖性效应发现，ABA浓度与种子萌发率呈负相关，随着ABA浓度增加，萌发率逐渐下降。而5-HT在1-10μM浓度范围内促进萌发。
外源施用5-HT以及提高内源5-HT水平均能缓解ABA介导的种子萌发抑制和植株衰老进程。与仅用10μM ABA处理的种子相比，经10μM 5-HT与ABA联合处理的种子在整个萌发期的萌发率显著更高。此外，对于经100μM ABA处理的幼苗，同时施用100μM 5-HT可使其在一周后的叶绿素保留量显著高于仅用ABA处理的幼苗（图3d–g）。这一表型在过表达5-HT合成关键酶T5H的转基因株系中得到进一步验证，该转基因株系对ABA的敏感性降低，具体表现为在ABA胁迫下萌发率升高、叶绿素保留能力增强（图3h-k）。综合以上结果表明，5-HT信号通路可拮抗依赖ABA的信号通路，并调控ABA介导的生理响应过程。
5-HT可调节ABA诱导的PP2C-SAPK2复合物形成
在ABA信号级联反应中，ABA与PYR/PYL/RCARs传感器模块结合，抑制蛋白磷酸酶2C型（PP2Cs）的活性，从而解除SNF1相关激酶亚家族2（SnRK2s）受PP2C介导的抑制。释放的SnRK2s随后磷酸化并激活AREBs/ABFs和ABI5，启动ABA诱导的转录重编程。我们对5-HT对ABA诱导的差异表达基因影响的分析显示，5-HT增强了激素信号通路中多个PP2C基因的富集（图4a）。在水稻中，SnRK2激酶亚群包括SAPK1-10（应激/ABA激活的蛋白激酶），其中SAPK2、SAPK6、SAPK8、SAPK9和SAPK10参与ABA信号传导。为了探索ABA信号通路中联合处理条件下富集的PP2C基因的潜在调控机制，我们进行了酵母双杂交（Y2H）实验。使用全长PP2C蛋白（BK-PP2Cs）作为“诱饵”，全长SAPK家族蛋白（AD-SAPKs）作为“猎物”，筛选蛋白质-蛋白质相互作用。初步结果确定了PP2C49与SAPK2、SAPK8、SAPK9和SAPK10之间的相互作用，以及PP2C30、PP2C49、PP2C51和SAPK2之间的相互作用（图4b）。鉴于SAPK2在这些相互作用网络中的核心作用，以及先前证据表明PP2C30/49/51通过SAPK2调节ABA信号传导，本研究特别侧重于阐明PP2Cs-SAPK2调控关系。
我们进一步通过分裂荧光素酶互补（SLC）和双分子荧光互补（BiFC）实验验证了烟草中SAPK2与PP2C30/49/51的相互作用。将PP2C-Cluc和SAPK2-Nluc构建体共转染至烟草叶片后，产生了强烈的发光信号（图4c）。同样地，在共表达PP2C-cYFP和SAPK2-nYFP构建体的烟草细胞核中，也观察到显著的黄色荧光信号（图4d）。此外，免疫共沉淀（Co-IP）和体外pull-down实验进一步证实了它们在体内和体外的相互作用（图4e、f）。综合这些结果，为PP2C30/49/51与SAPK2之间的相互作用提供了一致的证据。
既往研究表明，ABA通过与受体PYL5结合促进PYL5-PP2C30/49/51复合物的形成和稳定性，从而释放SAPK2并激活下游信号通路。为阐明5-HT在ABA介导的蛋白质-蛋白质相互作用中的调控作用，我们利用水稻原生质体和烟草瞬时表达系统，在不同处理条件下检测了PYL5与PP2C30/49/51的相互作用。10μM ABA处理显著增强了PYL5与PP2C30/49/51的相互作用。与单独ABA处理相比，10μM 5-HT和ABA的联合处理明显减弱了这种相互作用，但其强度仍高于未处理对照组。相反，单独使用10μM 5-HT处理对这些相互作用无显著影响。综上，这些结果表明5-HT可能通过干扰ABA诱导的PYL5-PP2C复合物组装来拮抗ABA信号传导。
图4.PP2Cs介导SAPK2的去磷酸化。a，热图分析显示，ABA和5-HT联合处理增强了激素信号通路中多个PP2C基因的表达。b，Y2H实验证实了PP2C30/49/51与SAPK2之间的相互作用。“LT”表示SD/-Leu/-Trp培养基，“LTHA”表示SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade培养基。c，SLC实验证明了PP2C30/49/51与SAPK2在本氏烟（Nicotiana benthamiana）叶片中的相互作用。图像在瞬时转化后三天拍摄。d，BiFC实验揭示了PP2C30/49/51与SAPK2在细胞核中的相互作用。黄色荧光表示相互作用信号。比例尺=20μm。e，Co-IP实验显示PP2C30/49/51与SAPK2相互作用。瞬时表达PP2Cs-Flag和ABI5-GFP的野生型水稻原生质体孵育18小时，随后进行GFP pull-down并使用抗Flag抗体检测。f，体外pull-down实验证实了PP2C30/49/51与SAPK2之间的相互作用。GST和GST-PP2Cs蛋白与SAPK2-His孵育，随后使用谷胱甘肽树脂进行pull-down，并用抗GST和抗His抗体检测。“PD”表示pull-down。g-h，体外激酶（g）和去磷酸化（h）实验显示PP2C30/49/51使SAPK2去磷酸化。在（g）中，CBB染色显示了共诱导的PP2Cs-GST或GST与SAPK2-His蛋白，并使用Phos-tag凝胶检测磷酸化蛋白。在（h）中，使用α-Ser/Thr免疫印迹检测磷酸化蛋白。（b–h）中的实验重复了三次，结果相似。
SAPK2被预测为丝氨酸/苏氨酸激酶，其强烈的自磷酸化活性通过使用抗磷酸化丝氨酸/苏氨酸（anti-Ser/Thr）抗体的免疫印迹分析得到证实。随后我们探究了特异性靶向丝氨酸/苏氨酸残基的PP2C30/49/51在SAPK2调控中的作用。在大肠杆菌中共表达SAPK2与PP2C蛋白显著降低了SAPK2的磷酸化水平（图4g）。体外去磷酸化实验也观察到一致结果，证实PP2C30/49/51负向调控SAPK2的自磷酸化（图4h）。鉴于磷酸化与去磷酸化在SnRK2激活中的关键作用（该过程是ABA信号传导的核心），我们提出5-HT可能通过拮抗ABA诱导的PYL5-PP2C复合物形成，从而影响SAPK2的磷酸化状态来调控ABA信号传导。
既往研究表明，SAPK2通过磷酸化下游bZIP转录因子（如bZIP23和ABI5，亦称bZIP10）参与ABA信号传导。然而，SAPK2介导的调控机制仍不明确。鉴于ABI5在ABA诱导的5-HT生物合成中的关键作用（图2），我们重点探究SAPK2与ABI5之间的潜在调控关系。为此，我们采用酵母双杂交（Y2H）、免疫共沉淀（Co-IP）、体外pull down、SLC及双分子荧光互补（BiFC）实验检测SAPK2与ABI5的相互作用。这些实验结果一致证实了SAPK2与ABI5的相互作用。
为探究SAPK2与ABI5之间的激酶-底物关系，我们进行了激酶活性检测。单独表达于大肠杆菌中的ABI5未显示磷酸化现象，而与SAPK2共表达时ABI5磷酸化水平显著升高，证实SAPK2为激酶（图5a）。体外激酶实验表明，重组ABI5与SAPK2蛋白可导致ABI5发生显著磷酸化（图5a），进一步验证SAPK2是负责ABI5磷酸化的激酶。随后，我们进一步评估了PP2C对SAPK2介导的ABI5磷酸化的影响。在大肠杆菌中共同诱导SAPK2与ABI5可导致ABI5磷酸化。然而，当PP2C与SAPK2及ABI5共表达时，未检测到显著的ABI5磷酸化，表明PP2C可抑制SAPK2驱动的ABI5磷酸化（图5b）。既往研究表明PP2C51可直接与ABI5相互作用使其去磷酸化。我们随后通过Y2H和SLC实验探究PP2C30与PP2C49是否也直接与ABI5相互作用。结果显示PP2C30/PP2C49与ABI5无直接相互作用，提示这些PP2C可能通过其他途径介导ABI5磷酸化。
图5.SAPK2 T162/T283决定ABI5的磷酸化。a，通过细菌激酶实验（左）和体外磷酸化实验（右）验证SAPK2介导的ABI5磷酸化。b，PP2C30/49/51对SAPK2介导的ABI5磷酸化的抑制作用。CBB染色确认共表达的PP2Cs-GST和SAPK2-His蛋白与ABI5-GST共存。c，通过LC-MS/MS鉴定的SAPK2自身磷酸化位点的部分肽段图谱，显示T159、T162和T283位点发生磷酸化。d，十个已鉴定的自身磷酸化位点对SAPK2激酶活性的验证。突变体m1-m5分别对应S12A、S109A/Y113A/S116A、T159A/T162A、T212A/T214A/S218和T283A。e，不同SAPK2自身磷酸化位点突变对其磷酸化ABI5能力的影响；其中T162/T159和T283对ABI5磷酸化至关重要，这些位点的丙氨酸替换消除了SAPK2介导的ABI5磷酸化。f，T159和T162突变对SAPK2自身磷酸化影响的分析，表明T162（而非T159）是SAPK2自身磷酸化所必需的。g-i，SAPK2自身磷酸化位点突变对其与ABI5相互作用的影响。共免疫沉淀（g）、SLC（h）和体外pull down（i）实验显示，T283位点突变破坏了SAPK2-ABI5相互作用，而其他位点突变未显著改变相互作用强度。在（a，d）中，使用小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）作为磷酸酶对照。在（a，b，d，e）中使用Phos-tag凝胶检测磷酸化蛋白；在（a，d-f）中进行α‑Ser/Thr免疫印迹以评估磷酸化状态。在（i）中，“PD”表示pull down实验。（a，b，d，e，f，g，h，i）所示实验均重复三次，结果相似。鉴于SAPK2具有强烈的自磷酸化活性，我们采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术鉴定其自磷酸化位点。共检测到10个磷酸化位点，其最佳肽段序列及质谱图如图5c所示。为探究这些位点的功能相关性，我们使用全长或变体SAPK2蛋白进行了体外激酶活性测定，其中特定磷酸化位点被替换为非磷酸化丙氨酸（图5d-f）。SAPK2T159A/T162A突变体完全丧失自磷酸化活性（图5d），这突显了这些位点磷酸化对SAPK2功能的重要作用。进一步分析表明，单独的T162A突变足以抑制SAPK2磷酸化，而T159A突变则无此效应（图5f）。这些结果表明，T162位点在调控SAPK2自磷酸化活性中起重要作用。
为评估这些突变对ABI5磷酸化的影响，我们将磷酸化失活的SAPK2变体与ABI5共表达。结果显示，丧失自磷酸化活性的SAPK2T162A突变体无法磷酸化ABI5，证实T162位点磷酸化对SAPK2激酶活性及ABI5磷酸化均具有关键作用（图5e）。尽管SAPK2T283A突变体保留自磷酸化能力，但其对ABI5的磷酸化活性显著降低（图5e），提示该位点对SAPK2介导的ABI5磷酸化至关重要。进一步分析表明，与其他突变体相比，SAPK2的T283A突变显著削弱了其与ABI5的相互作用，这一结果通过SLC、免疫共沉淀（Co-IP）及体外pull down实验得到一致验证（图5g-i）。这些发现强调了T283磷酸化在介导SAPK2与ABI5相互作用及后续磷酸化过程中的关键作用。综上，我们的研究结果凸显了T162和T283磷酸化在调控SAPK2介导的ABI5磷酸化中的重要作用。
鉴于5-HT可能拮抗ABA诱导的PYL5-PP2C复合物形成，从而影响SAPK2介导的ABI5磷酸化，我们检测了5-HT对ABA诱导的ABI5磷酸化的影响。通过抗ABI5抗体评估了不同处理下水稻幼苗中ABI5的磷酸化水平。外源5-HT施用及内源5-HT水平升高的转基因植株均显著降低了ABA诱导的ABI5磷酸化（图6a、b）。这些结果表明5-HT部分减弱了ABA诱导的ABI5磷酸化，支持了5-HT通过可能的PP2C-SAPK2相互作用至少部分影响ABA驱动的ABI5磷酸化的假说。虽然5-HT处理没有显著改变ABA响应下的ABI5转录水平，但它显著降低了ABI5蛋白水平（图6c，d），这表明ABI5磷酸化可能影响其蛋白稳定性。体外无细胞降解实验显示，在野生型水稻幼苗的总蛋白提取物中，SAPK2磷酸化的GST-ABI5比未磷酸化形式降解得更慢（图6e）。此外，ABA处理24小时后，与未处理对照相比，总蛋白提取物中ABI5蛋白稳定性显著更高（图6f）。这些发现表明，5-HT通过调节ABA诱导的ABI5磷酸化，从而影响ABI5蛋白积累。
图6. 5-HT对ABA诱导ABI5磷酸化及稳定性的影响。a，测定水稻幼苗经ABA单独处理或与5-HT联用（ABA+5-HT）12小时后的ABI5磷酸化水平。b，比较ABA处理12小时后Ubi::T5H转基因植株与野生型（WT）的ABI5磷酸化水平。c-d，分析ABA单独处理及ABA联合5-HT处理对ABI5转录本(c)和蛋白水平（d）的影响。e，评估磷酸化对ABI5蛋白稳定性的影响，其中ABI5p表示与SAPK2-His共表达的磷酸化ABI5-GST融合蛋白，ABI5代表独立表达的非磷酸化蛋白。f，比较ABA处理12小时后水稻幼苗总蛋白提取物中ABI5蛋白的稳定性与未处理对照组。图（c）数据以均值±标准差表示（n=3个生物学重复）。图（a、b、d、e、f）所示实验均重复三次，结果一致。
本研究系统探究了ABA与水稻5-HT代谢通路的相互作用机制。我们的目标是阐明5-HT合成的调控机制，同时在保持产量稳定的前提下，促进水稻体内5-HT及其衍生物褪黑激素的积累。研究发现，ABA通过激活ABI5基因可影响5-HT生物合成，进而诱导TDC1、TDC3和T5H基因的转录上调，从而促进5-HT/MT的合成。此外，结果表明5-HT生物合成的反馈调节可能涉及ABA信号通路。基于这些发现，我们提出了两种无需牺牲产量即可提高水稻籽粒中5-HT/MT含量的工程化策略（图7a，i）。第一种策略通过靶向ABA代谢相关基因来提升内源性ABA浓度，从而增强5-HT/MT合成；第二种策略则针对ABA信号通路核心环节，以减弱5-HT介导的负反馈调节。
为了评估两种增强水稻特定性状策略的有效性，我们构建了在Ubi启动子下组成型过表达目标基因的转基因系，包括参与ABA生物合成的NCED基因家族成员，以及与5-HT反馈调节途径相关的ABI5和SAPK2基因。我们还利用CRISPR/Cas9技术敲除了与ABA分解代谢相关的基因（CRaba8oxs），并生成了PP2C51的突变体（CR-PP2C51），后者是ABI5磷酸化的调节因子。通过将CR-PP2C51突变等位基因与过表达盒结合（CR-PP2C51/Ubi::ABI5），进一步开发了双转基因系。对这些与ABA代谢相关的转基因系籽粒中ABA含量的分析显示，大多数转基因系的ABA水平显著高于对照组，证实了水稻籽粒内源性ABA含量的增强。
作为关键的内源性激素，ABA在植物生长发育中发挥核心调控作用。通过对ABA信号增强型转基因水稻株系的内源ABA水平及表型性状进行系统分析，我们评估了ABA调控对农艺性状的多维度影响。种子萌发实验表明，与野生型对照相比，ABA含量升高或ABA信号增强的转基因株系萌发率显著降低。对产量构成要素的全面评估显示，大多数转基因株系在千粒重、单株实粒数、分蘖数、株高及单株产量等主要农艺性状上均未呈现统计学显著差异（图7b-e）。NCED3过表达株系则表现出产量显著提升。总体而言，我们的表型分析表明，通过调控ABA含量或信号传导来提高水稻5-HT/MT水平，可显著抑制种子萌发，且不会对营养或生殖产量构成要素产生负面影响。
鉴于大米作为全球主食通常需经烹煮后食用，我们进一步评估了两种遗传策略对烹煮转基因大米籽粒中5-HT/MT含量的影响。定量分析显示，75%（8/12）的独立转基因品系表现出5-HT含量显著增加。在这8个5-HT水平升高的品系中，75%（6/8）还伴随MT积累量的同步增加（图7f-h）。这些结果表明两种策略均能有效提升烹煮大米籽粒中目标化合物的生物合成。通过比较野生型大米籽粒烹煮前后的5-HT与MT水平，发现烹煮过程导致其含量显著降低，暗示转基因大米籽粒在烹煮前可能含有更高浓度的这些化合物。总体而言，本研究提出了一种创新的分子设计策略，可在不损害产量稳定性的情况下提升主粮作物功能性营养素含量。
图7.在不影响产量的前提下培育5-HT/MT富集水稻。a，野生型（WT）与本研究生成的12个转基因水稻品系在成熟期的表型及单株籽粒产量。品系L1–L12分别对应Ubi::NCED1、Ubi::NCED2、Ubi::NCED3、Ubi::NCED4、Ubi::NCED5、CR-aba8ox1、CR-aba8ox2、CR-aba8ox3、Ubi::SAPK2、Ubi::ABI5、CR-pp2c51和Ubi::ABI5/CR-pp2c51。比例尺=10厘米。b-e，对农艺性状的统计分析，包括分蘖数（b）、千粒重（c）、每穗实粒数（d）及单株产量（e）的野生型与转基因植株数据。多数转基因品系未表现出单株产量的显著变化，而SAPK2过表达导致产量轻微下降。f-h，野生型与12个转基因品系熟米表型外观（f），以及熟米中5-HT（g）和MT（h）含量的定量分析。转基因与野生型品系熟米外观未观察到显著差异。