无籽刺梨果实生长发育期间，其形态特征会发生显著变化。从RS1期（开花前7天）到RS4期（开花后28天），果实持续膨大，颜色由深绿色逐渐转变为浅绿色（图1A）。研究收集了RS1至RS4期的样品，以探究内源激素的动态变化。结果表明，随着果实发育，吲哚乙酸（IAA）和茉莉酸（JAs）的含量逐渐下降。并在RS3期和RS4期维持在低水平（图1B、G）。细胞分裂素（CTKs）、脱落酸（ABA）和水杨酸（SAs）的含量起初呈上升趋势，在盛花期达到峰值后逐渐下降（图1D-F）。赤霉素（GAs）在前期两个阶段含量极低，但从坐果期开始显著升高（图1C），这表明GAs参与无籽刺梨果实的生长发育过程。

为进一步探究GAs与无籽刺梨坐果的关系，在开花前对花朵进行去雄处理，随后分别喷施GA₄₊₇、多效唑（PAC，一种赤霉素合成抑制剂）和蒸馏水（对照），观察其对坐果和果实发育的影响。结果显示，处理后14天（DAT），PAC处理组的幼果开始脱落，坐果率降至48.88%。处理后30天，GA₄₊₇、PAC和H₂O处理组的坐果率分别为95.56%、17.78%和88.89%，PAC处理组坐果率大幅下降。处理后45天，GA₄₊₇和H₂O处理组的坐果率仍高达93.33%和82.22%，而PAC处理组的果实全部脱落（图2A）。因此，无籽刺梨具有较强的天然单性结实能力，且GAs在坐果过程中发挥重要作用。

从处理后7天至21天，对不同处理组的果实大小和细胞大小进行观察。GA₄₊₇处理组的果实直径和重量显著大于H₂O处理组，而H₂O处理组又优于PAC处理组。GA₄₊₇和H₂O处理组的果实持续膨大，而PAC处理组的果实在处理后7天达到最大尺寸，随后停止生长并脱落（图2B-C、E）。此外，不同处理组的细胞大小存在显著差异。在相同检测阶段，GA₄₊₇处理组的细胞尺寸更大（图2D），尽管未观察到显著的细胞分裂，但仍形成了更大的果实。相反，PAC处理组的果实细胞尺寸小于GA₄₊₇和H₂O处理组（图2D）。在果实成熟阶段，GA₄₊₇处理组的果实成熟更早，且果实大小显著大于H₂O处理组（图2F）。综上，GAs对无籽刺梨果实发育也具有重要作用。

通过对无籽刺梨果实四个发育阶段的转录组测序，共鉴定出113310个基因。相邻阶段差异表达基因（DEGs）的显著性分析表明，盛花期（RS2）与坐果初期（RS3）之间的差异表达基因数量最多，达8279个，其次是RS3与RS4之间的4329个，而RS1与RS2之间的差异表达基因最少，仅431个（图3A）。对盛花期（RS2）与坐果初期（RS3）之间的差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。GO富集分析的前20个显著条目主要归类于生物学过程（BP），这些差异表达基因主要参与生物合成与分解过程、细胞壁组织和细胞发育过程，与坐果密切相关（图3B）。

KEGG富集分析显示，盛花期和坐果初期的DEGs主要集中在类黄酮生物合成、二萜类生物合成和植物激素信号转导等通路（图3C）。此外，对前20个KEGG通路进行富集弦图分析，结果表明大多数基因分布在不同通路中，参与多种生物学过程。例如，基因TRINITY_DN5137_c0_g1（芳香族氨基酸转氨酶）参与异喹啉生物碱生物合成、三肽、哌啶和吡啶生物碱生物合成、苯丙氨酸代谢以及醌和其他萜类-醌衍生物的生物合成等多个通路（图3D）。本研究深入分析了二萜类生物合成通路，以阐明GA生物合成通路中相关基因的表达模式。

对RS2和RS3阶段的KEGG富集分析发现，RsGA3ox基因在GA₁和GA₄生物合成通路中显著上调，这与盛花期至坐果初期GA含量的变化趋势一致，表明RsGA3ox在GA生物合成中可能发挥作用（图3E）。此外，对RsGA3ox在四个阶段的表达模式进行定量分析，发现其在RS1和RS2阶段无显著变化，而从RS2到RS4阶段显著上调（图3F）。随后，分析了RsGA3ox在H₂O、GA₄₊₇和PAC处理下的表达模式。结果显示，GA₄₊₇处理组的RsGA3ox在处理后7天上调，并持续至14天，而PAC处理组的RsGA3ox表达水平始终维持在极低水平（图3G），表明RsGA3ox在该果树的果实生长和发育中具有重要功能。

图3.无籽刺梨差异表达基因的富集分析及RsGA3ox基因的表达模式。（A）四个阶段的差异表达基因统计。（B）RS2与RS3之间差异表达基因的GO富集分析。（C）RS2与RS3之间差异表达基因的KEGG富集分析。（D）RS2与RS3之间差异表达基因的KEGG富集弦图分析。（E）赤霉素生物合成通路及相关基因的转录组表达热图。（F）RsGA3ox在四个阶段的相对表达水平。（G）RsGA3ox在H₂O、GA₄₊₇和PAC处理下的表达模式。数据为三次生物学重复的平均值±标准差，同一图中不同字母表示差异显著（P<0.05）。

为阐明在果实生长发育中起关键作用的基因，基于无籽刺梨全基因组数据，对赤霉素氧化酶基因（GAoxs）家族成员进行了鉴定。共从无籽刺梨中鉴定出43个GAoxs家族成员，分为三个亚家族：14个RsGA2ox（赤霉素2-氧化酶）成员、14个RsGA3ox（赤霉素3-氧化酶）成员和15个RsGA20ox（赤霉素20-氧化酶）成员（图4A）。根据它们在染色体上的位置，分别命名为RsGA2ox1至RsGA2ox14、RsGA3ox1至RsGA3ox14以及RsGA20ox1至RsGA20ox15。染色体分布分析显示，RsGAoxs分布在14条染色体中的13条上，仅A5染色体上没有分布。A7和B7染色体上的RsGAoxs数量最多。利用无籽刺梨的43个GAoxs成员以及拟南芥、水稻、葡萄和苹果的GAoxs成员构建系统发育树，结果表明所有成员聚类为不同的亚家族，且无籽刺梨的GAoxs数量与苹果接近，显著高于其他三个物种，表明无籽刺梨和苹果相比其他物种具有更强的GA生物合成和代谢潜力（图4B）。随后，对43个RsGAoxs的7个重要指标（氨基酸数量、分子量、等电点、不稳定指数、脂肪族指数、亲疏水性和亚细胞定位）进行了预测，这些信息为深入了解这43个基因的分子特征提供了关键见解，并为后续研究提供了理论基础。

对43个成员的基因结构分析显示，大多数基因缺乏5'非翻译区（UTRs），编码序列（CDS）主要在1500bp以内。保守结构域分析表明，每个主要的RsGAox亚家族都含有特定的保守结构域：RsGA2ox和RsGA20ox各含有两个特定保守结构域，而RsGA3ox含有四个特定保守结构域。顺式作用元件分析表明，在这些基因的2000bp上游区域存在多个与激素响应密切相关的元件，包括赤霉素响应元件、MYB结合位点、生长素响应元件和脱落酸响应元件（图4C）。同时，对43个RsGAoxs的表达模式（TPM）进行分析，结果显示RsGA2oxs基因在坐果初期表达水平较低，而在后期表达水平较高。相反，RsGA3oxs和RsGA20oxs的表达水平在前期较高，后期降低。这表明RsGA3oxs和RsGA20oxs与果实发育趋势一致，可能对无籽刺梨果实发育有贡献。

图4.无籽刺梨赤霉素氧化酶基因（GAoxs）家族的全基因组鉴定。（A）GAoxs家族成员的鉴定。（B）无籽刺梨RsGAoxs与拟南芥、水稻、葡萄和苹果GAoxs基因的系统发育树。（C）RsGAoxs的基序、保守结构域、顺式作用元件和基因结构分析。

为探究RsGAoxs的共线性，基于基因组数据进行了种间和种内共线性分析。结果表明，水稻与无籽刺梨的共线基因对最少，仅6对，分布在水稻的1号染色体上。相反，拟南芥与无籽刺梨共享16个共线基因对，分布在1、2、4和5号染色体上，其中1号染色体上的分布最为集中（图5A）。月季和刺梨与无籽刺梨的共线性关系更为广泛，分别有37和39对共线基因对。值得注意的是，刺梨表现出最密切的共线性，共线基因的染色体位置和顺序高度保守（图5A）。

随后对无籽刺梨的自我共线性分析显示，30个基因存在共线性关系，其中大多数源于A组和B组染色体之间的复制事件。值得注意的是，RsGA2ox5、RsGA2ox6、RsGA2ox7和RsGA2ox14的共线性仅发生在4号和6号染色体之间，这可能由于基因扩增导致（图5B）。同时，计算了刺梨、无籽刺梨和月季之间RsGAoxs的同义替换率（Ks），以模拟这三个物种的全基因组复制（WGD）事件。结果显示，在-0.5至0.5之间存在一个显著的峰值，表明这三个物种共享一个重要的基因复制事件，可能与祖先真双子叶植物的辐射分化一致。此外，在2至2.5之间存在一个次要峰值，与之前基于全基因组分析报道的WGD时间线相比略有延迟（图5C），表明蔷薇属中RsGAoxs的复制时间较晚。

图5.无籽刺梨GAoxs家族的共线性分析。（A）RsGAoxs与拟南芥、水稻、月季和刺梨的全基因组共线性分析。（B）RsGAoxs的自我共线性分析。（C）刺梨、无籽刺梨和月季之间GAoxs的同义替换率（Ks）分布。

为鉴定RsGA3ox家族的特定成员，进行了序列比对，鉴定出RsGA3ox9，其与之前的候选基因RsGA3ox具有100%的序列一致性。为验证RsGA3ox9与单性结实的关联，通过番茄过表达和无籽刺梨病毒诱导基因沉默（VIGS）实验进行了功能分析。使用CaMV35S启动子，经过筛选、分化和生根过程，再生出完整的转基因植株。共获得10个转基因株系（OE-1至OE-10，分别表示番茄过表达株系1-10）（图6A），选择其中三个RsGA3ox9表达水平极高的株系（OE-2、OE-7和OE-9）进行进一步分析（图6B）。在开花前两天，对转基因植株和野生型（WT）的花朵进行去雄处理，以观察表型。结果表明，在不去雄处理下，转基因植株和野生型植株均能正常结果，表型无显著差异（表1）。相反，在去雄处理下，野生型的子房迅速脱落，无法形成果实，而转基因植株的子房能够继续正常发育形成无籽果实（图6C）。然而，去雄处理的转基因植株与不去雄对照相比，坐果率较低（平均为10.2-17.3%），果实重量也较小（平均为1.25-1.27g）（表1）。

为直接验证RsGA3ox9在单性结实中的作用，还对无籽刺梨的果实进行了VIGS分析。结果显示，处理后10天，基因沉默果实的RsGA3ox9表达水平与对照相比显著降低，证实了基因沉默的有效性（图6D）。此外，基因沉默果实的生长受到抑制，直径小于对照。处理后20天，果实完全枯萎，最终脱落（图6E）。这表明RsGA3ox9对无籽刺梨的果实发育具有重要作用。

表1.转基因番茄和野生型的单性结实能力

注：数据为三次生物学重复的平均值±标准差，同一列中不同字母表示差异显著（P<0.05）。

图6.通过番茄过表达和无籽刺梨果实VIGS实验共同验证RsGA3ox9的功能。（A）转基因植株的PCR验证。（B）WT和过表达株系中RsGA3ox9的相对表达水平，OE-4的相对表达水平设为1。（C）野生型和过表达株系在不去雄和去雄处理下的果实表型。（D）对照（CK）和沉默（VIGS）果实中RsGA3ox9的相对表达水平。（E）对照和沉默果实在处理后10天和20天的表型。数据为三次生物学重复的平均值±标准差，同一图中不同字母表示差异显著（P<0.05），星号表示差异极显著（Student's t检验，***P<0.001）。