英文题目：Sprouting Enhances Submergence Tolerance in Rice by Promoting Glutathione Biosynthesis and Turnover
中文题目：催芽通过促进谷胱甘肽生物合成与周转增强水稻耐淹性
期刊名称：antioxidants
影响因子：6.6
作者单位：湖南杂交水稻研究中心
普奈斯提供服务：植物理化检测
DOI号：https://doi.org/10.3390/antiox14121387
淹水胁迫是制约水稻直播生产的主要障碍，会严重抑制种子萌发与幼苗建成，导致减产。深入解析其生理机制并开发缓解策略，对稳定水稻生产具有重要意义。“催芽”作为一项传统农艺措施，早在《齐民要术》中就有记载，前期研究显示其可增强水稻苗期的抗氧化能力，但催芽是否以及如何提高耐淹性尚不明确。
本研究以“华占”（HZ）和“耘两优玖48”（YLYJ48）水稻品种为试验材料，采用浸种催芽处理、外源谷胱甘肽（GSH）添加、转录组测序、生化指标测定及田间验证等方法，结合统计模型分析发现：48小时催芽处理可显著提升淹水胁迫下水稻的苗高和根长（YLYJ48品种分别提升163%和423%），其核心机制为催芽处理能上调谷胱甘肽还原酶（GR）活性及相关基因表达，促进GSH生物合成（HZ品种GSH含量从64.86μg/g FW升至83.00μg/g FW，YLYJ48从82.14μg/g FW增至92.52μg/g FW），强化幼苗的抗氧化能力；0.1%外源GSH浸种可有效模拟催芽的耐淹效应，使淹水条件下水稻苗高提升约50%，且田间试验证实该处理能使不同品种水稻成苗率提高30%~35%；此外，转录组分析表明催芽处理可重塑谷胱甘肽代谢通路，调控合成、再生及利用相关基因的表达，为水稻耐淹性提升提供分子层面支撑，该研究为直播稻耐淹栽培提供了低成本、可推广的技术方案与理论依据。
为评估催芽对淹水胁迫下水稻生长的影响，本研究比较了YLYJ48品种在不同催芽时长（0、12、24、36、48小时）下，常规水培和淹水胁迫条件下的苗高动态变化（图1A、B）。常规水培条件下，不同催芽处理组的苗高生长动态无显著差异，说明无胁迫时催芽对最终苗高及伸长速率影响有限；而淹水胁迫下，各处理组生长动态差异显著：0小时和12小时处理组的苗伸长在淹水3天后基本停滞，24小时及更长催芽处理组的苗伸长则持续进行，其中48小时处理组的苗伸长速率显著高于其他组。结合常规稻品种HZ在淹水胁迫下的表型数据（图1C）发现，两个遗传背景差异显著的品种（HZ和YLYJ48）的幼苗表型均随催芽时长延长而显著改善。在YLYJ48品种中，与0小时处理相比，48小时处理的苗高和根长分别提升163%和423%，HZ品种也呈现相似的促进效应。
然而，这种快速生长伴随着氧化损伤。生化分析显示，在淹水胁迫下，两个品种幼苗的丙二醛（MDA）含量均随催芽时长延长显著升高（图1D）。对过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）三种关键抗氧化酶活性的测定表明，两个品种24小时处理组的酶活性均显著优于0小时处理组；尽管48小时处理组的酶活性较24小时组有所下降，但仍高于0小时处理组。上述结果表明，水稻种子催芽处理可改变其在完全淹水条件下后续的生长动态及生化响应。
图1.不同催芽处理下水稻幼苗对淹水胁迫的表型及生化响应。（A）YLYJ48水稻种子经0~48小时催芽处理后，幼苗在6天淹水胁迫下的表型。（B）6天处理周期内，正常水培和淹水条件下YLYJ48的苗高动态变化。（C）HZ和YLYJ48两个品种幼苗经6天淹水胁迫后的苗高及根长。（D）HZ和YLYJ48幼苗经6天淹水胁迫后的丙二醛（MDA）含量，以及过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性。注：HZ即华占，YLYJ48即耘两优玖48（均为水稻品种）；0小时、12小时、24小时、36小时、48小时为种子经统一24小时浸水处理后，开展催芽处理的时长；MDA为丙二醛，CAT为过氧化氢酶，SOD为超氧化物歧化酶，POD为过氧化物酶；图B~D中误差线代表3次重复实验的标准差（n=3）；不同字母表示组间存在显著差异（单因素方差分析结合Tukey多重比较检验，p<0.05）。（1）转录组测序（RNA-Seq）分析及差异表达基因（DEGs）鉴定
对HZ和YLYJ48品种的18份水稻种子样品经0、24、48小时催芽处理的RNA-Seq测序分析，共产生7.68亿条下机数据，质控后获得7.46亿条高质量clean reads，Q30碱基占比均高于95.27%，平均GC含量为51.48%。所有样品的基因组比对率均超过92%，证实数据质量可靠，满足分析要求。样品间相关性分析显示，同处理组内重复性良好（R2>0.90）；主成分分析（PCA）表明不同催芽处理组间分离明显，生物学重复在组内聚类紧密。差异表达分析显示，各处理间存在大量转录水平显著变化：相较于HZ-0小时组，HZ-24小时组存在8494个差异基因（5778个上调，2716个下调），HZ-48小时组差异基因达12401个（8169个上调，4232个下调）；同理，YLYJ48-24小时组和YLYJ48-48小时组相较于YLYJ48-0小时组，分别存在9061个（6096个上调，2965个下调）和11705个（7862个上调，3843个下调）差异基因（图2）。差异基因数量随处理时长及遗传背景的不同呈现差异。
图2.不同催芽处理下水稻种子中的差异表达基因（DEGs）。（A）相较于0小时催芽处理的对照组，YLYJ48和HZ两个水稻品种在24小时、48小时催芽处理下的差异表达基因数量。（B）不同催芽处理组之间差异表达基因的特有及共有分布情况。注：样本对比的命名格式为“品种-催芽时长-vs.-品种-0h”，其中HZ为华占水稻品种，YLYJ48为耘两优玖48水稻品种；0小时、24小时、48小时为种子经24小时统一浸水处理后开展催芽处理的时长（例如，HZ-24h-vs.-HZ-0h表示华占品种24小时催芽处理组与其0小时催芽处理对照组的对比）；UP代表上调的差异表达基因，DOWN代表下调的差异表达基因。（2）不同催芽处理下差异基因的GO及KEGG通路富集分析
通过整合HZ-24h-vs.-HZ-0h、HZ-48h-vs.-HZ-0h、YLYJ48-24h-vs.-YLYJ48-0h、YLYJ48-48h-vs.-YLYJ48-0h四组比较的差异基因，发现两个水稻品种经催芽处理后的基因表达模式存在一定相似性。为系统解析这些差异基因的生物学功能，本研究开展了GO和KEGG富集分析（图3）。
GO功能富集结果显示，差异基因可分为生物过程、细胞组分和分子功能三大类。24小时催芽处理下，两个品种均显著富集于过氧化物酶活性（GO:0004601）、氧化胁迫响应（GO:0006979）、过氧化氢分解代谢过程（GO:0042744）、活性氧响应（GO:0000302）、谷胱甘肽代谢过程（GO:0006749）等抗氧化相关过程；48小时处理下，除上述抗氧化过程（过氧化氢分解代谢、氧化胁迫响应、谷胱甘肽代谢）外，还诱导了植物型次生细胞壁生物发生（GO:0009834）、脂质分解代谢过程（GO:0016042）、碳水化合物代谢过程（GO:0005975）等通路。这些变化表明，48小时催芽处理下，水稻种子开始大量形成次生细胞壁以保障机械强度、水分运输及抗逆性；而脂质和碳水化合物代谢的协同变化则体现了细胞生长的能量需求。
KEGG通路分析显示，24小时催芽处理下，两个品种的差异基因均显著富集于谷胱甘肽代谢（osa00480）及其合成相关通路——半胱氨酸和蛋氨酸代谢（osa00270）；同时，苯丙烷类生物合成（osa00940）、二萜类生物合成（osa00904）、类胡萝卜素生物合成（osa00906）等次生代谢物合成通路也富集了大量差异基因，这些通路参与植物抗病、抗虫、紫外防护及光保护等功能；此外，淀粉和蔗糖代谢（osa00500）、糖酵解/糖异生（osa00010）、半乳糖代谢（osa00052）等能量供给相关碳水化合物代谢通路同样高度富集。48小时催芽处理下，谷胱甘肽代谢网络仍维持高活性。上述转录水平的变化为催芽处理诱导抗氧化能力提升提供了分子层面的解释。
图3. YLYJ48水稻种子经48小时与0小时催芽处理后差异表达基因的功能富集分析。（A）GO富集分析：展示富集程度排名前30的显著功能条目。GO富集分析可从生物过程、细胞组分、分子功能三个维度，解析差异表达基因的核心生物学功能，前30的显著条目代表差异基因集中参与的关键生物学事件。（B）KEGG通路富集分析：展示富集程度排名前20的显著代谢通路。KEGG通路富集分析能够定位差异表达基因参与的具体代谢或信号通路，前20的显著通路可反映催芽处理对水稻种子生理代谢调控的核心通路方向。
（3） 催芽对水稻谷胱甘肽代谢通路关键基因的调控
为探究催芽处理对水稻抗氧化系统的调控机制，本研究对差异基因进行通路富集分析，共筛选到60个富集于谷胱甘肽代谢通路的差异基因（图4）。与0小时对照相比，该通路中多个关键基因的表达随催芽时长延长发生显著变化。
谷胱甘肽合成（GSS）、还原再生（GR、IDH、G6PD）、转运结合（GST）及抗坏血酸-谷胱甘肽循环（DHAR、APX）相关基因的表达随催芽处理时长延长显著上调；而与之相反，GPX和ORDX6的表达呈显著下调趋势。这两个基因编码的酶以GSH为底物清除过氧化物，在谷胱甘肽氧化还原循环中发挥关键作用，其与GR相反的表达模式可能对植物内源抗氧化物质GSH含量及GSH/氧化型谷胱甘肽（GSSG）平衡产生重要影响。
图4.催芽处理后水稻种子中的谷胱甘肽代谢通路。图中热图展示了不同催芽时长下该通路中差异表达基因（DEGs）的表达水平，基因表达量以Z值进行标准化呈现。图中各酶类缩写的具体定义如下：GGCT为γ-谷氨酰环转移酶；OPLAH为5-氧代脯氨酸酶；PepA为特定的氨肽酶P；GGT为γ-谷氨酰转移酶；GSS为谷胱甘肽合成酶；GR为谷胱甘肽还原酶；IDH为异柠檬酸脱氢酶；G6PD为葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶；GPX为谷胱甘肽过氧化物酶；ORDX6为氧化还原酶6；DHAR为脱氢抗坏血酸还原酶；GST为谷胱甘肽S-转移酶；RRM1为核糖核苷二磷酸还原酶大亚基；APX为抗坏血酸过氧化物酶。本研究中的谷胱甘肽代谢通路图基于KEGG参考通路图（编号map00480）绘制，绘图风格参考了前人的研究；而用于呈现基因表达Z值的热图数据为本文原始实验数据。
鉴于催芽对谷胱甘肽代谢通路的显著影响，本研究测定了不同催芽时长（0、24、48小时）下种子的MDA含量、GR和GPX活性以及GSH和GSSG水平，结果显示催芽显著改变了种子的内源生化状态（图5）。非胁迫条件下，MDA含量随催芽时长延长逐渐升高，说明催芽过程中持续的代谢活动本身会对种子造成一定程度的氧化胁迫；同时，催芽显著提升了GR的基础活性，而GPX活性在各处理间无显著差异，整体保持稳定。内源GSH含量随催芽时长延长呈上升趋势；但GSSG含量变化无统一规律，两个品种均在24小时催芽处理后基础GSSG水平最低，48小时处理后最高；GSH/GSSG比值在0小时和48小时处理组间无显著差异，而24小时处理组显著高于前两者。上述结果表明，催芽处理可提升种子内源GSH水平及再生能力，为幼苗在淹水胁迫下维持快速生长提供关键的抗氧化支撑。
图5.不同催芽时长下水稻种子的生化指标。（A）丙二醛（MDA）含量；（B）谷胱甘肽还原酶（GR）活性；（C）谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性；（D）还原型谷胱甘肽（GSH）含量；（E）氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量；（F）GSH/GSSG比值。注：图A~F中误差线均代表3次重复实验的标准差（n=3）；不同字母表示组间存在显著差异（单因素方差分析结合Tukey多重比较检验，p<0.05）。
为验证谷胱甘肽在提升耐淹性中的作用，本研究以YLYJ48水稻为材料优化GSH浓度（图6）。表型筛选结果显示0.1%为最优浓度，而1%的高浓度处理则表现出抑制效应。后续对两个品种的试验证实，0.1%GSH处理可显著提高种子中GSH和GSSG含量，同时降低GR和GPX活性；经该处理的幼苗在淹水后苗伸长量较对照提升约50%。
对四个遗传背景不同的水稻品种开展的田间试验证实了该方法的广泛适用性：0.1%GSH处理可稳定提升各品种的耐淹性，显著促进所有供试品种的苗和根生长；尤为重要的是，该处理可大幅提高田间条件下的成苗率，不同品种的成苗率绝对增幅在30%~35%之间。
图6.外源谷胱甘肽对水稻耐淹性的影响。（A）YLYJ48水稻种子经不同浓度谷胱甘肽（GSH，浓度梯度为0、0.001%、0.01%、0.1%、1%，质量体积比）处理后，其幼苗在6天淹水胁迫下的表型。（B）HZ和YLYJ48两个水稻品种的种子经0.1%（质量体积比）GSH处理后的基础生化指标，以及对应幼苗经6天淹水胁迫后的苗高。注：图B中误差线代表3次重复实验的标准差（n=3）；ns表示组间无显著差异；**代表组间差异极显著（p<0.01）；***代表组间差异极显著（p<0.001），显著性检验采用双尾t检验。
本研究证实，催芽可通过调控谷胱甘肽代谢相关基因的表达，提升谷胱甘肽含量及整体抗氧化防御能力，进而显著促进水稻幼苗生长；此外，外源GSH施用试验验证了其在农业生产中缓解淹水胁迫的实际效用。研究结果支持在小农户种植中推广催芽技术，在规模化直播稻生产中应用GSH种子处理技术。