不同种植地点的庐山褐皮土豆块茎内生微生物群多样性存在差异
为了检测不同种植地点的庐山麻皮土豆块茎微生物群组成多样性,我们分别通过16S rRNA基因和核rRNA内部转录间隔区(ITS)的DNA扩增子测序,分析了LsM和LS块茎的细菌和真菌内生群落。
我们从两组土豆块茎(LsM和LS,每组8个样品重复)的16个样品中分别获得了3,000,147个和4,583,280个有效序列,用于16S rRNA和ITS检测。过滤宿主序列后,剩余641,505个和109,483个纯净序列用于进一步分析。最终,我们生成了4074个细菌群落检测的扩增子序列变体(ASVs)和311个真菌群落检测的扩增子序列变体(ASVs)。Chao1、Shannon和Simpson指数显示,不同块茎之间细菌群落和真菌群落的α多样性没有显著差异,表明细菌和真菌内生菌的丰富度没有显著差异。
基于Bray-Curtis距离,使用主坐标分析(PCoA)分析细菌和真菌内生菌的β多样性,并使用前两个主坐标生成主坐标分析图(图5A、C)。在细菌和真菌内生菌中,两组(LsM和LS)的土豆块茎基本聚为两组,尤其是细菌内生菌检测(图5A、C)。第一主坐标(PC1)解释了样品间细菌组成差异总变异的25.4%,第二主坐标(PC2)解释了另外17%的变异。这两个主轴共同捕获了42.4%的整体细菌内生群落变异(图5A)(adonis R2:0.17,adonis p值:0.001667,离散度p值:0.774)。对于真菌内生群落,第一主成分解释了73.1%的变异,而第二主成分解释了14.2%的变异(adonis R2:0.18,adonis p值:0.053833,离散度p值:0.145)(图5C)。这些数据可能表明,微生物群落的最大变异源来自马铃薯块茎的差异。
丰度谱分析鉴定了在LsM和LS中持续富集的细菌和真菌类群(图5B、D)。我们的数据显示,变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteriota)和帕特斯细菌门(Patescibacteria)是优势细菌门,变形菌门和放线菌门是LsM组中最优势的门,丰度分别为52.8%和17.6%,但这些细菌门在LS组中丰度降至17.5%和14.8%,而厚壁菌门和帕特斯细菌门的丰度与LsM组相比,在LS组中从10%和2%增加到34%和20%(图5B)。先前的研究报道,厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门是块茎组织中的优势微生物门,这与我们的数据一致。然而,也观察到某些差异,这可能归因于所检查块茎的不同生理状态。具体而言,那些研究中的块茎是在发芽阶段采样的,而本研究中的实验材料是新鲜收获的块茎。此外,我们的数据显示,来自不同种植地点的块茎内生微生物组成存在显著差异。总之,这些发现表明,块茎的内生微生物群落受到宿主生理状态和生长环境的强烈影响。
图5. LsM和LS土豆块茎内生细菌和真菌群落的β多样性和门水平相对丰度。(A)基于Bray-Curtis距离的内生细菌主坐标分析(PCoA)图。(B)内生细菌的门水平相对丰度。(C)基于Bray-Curtis距离的内生真菌主坐标分析(PCoA)图。(D)内生真菌的门水平相对丰度。
由于现有真菌数据库中缺乏全面的参考序列,测序获得的大部分真菌扩增子序列变体(ASVs)无法分配到明确的分类等级,因此被归类为“未分类”。在成功获得分类注释的真菌扩增子序列变体(ASVs)中,它们隶属于六个主要门,即子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)、毛霉门(Mucoromycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和罗兹菌门(Rozellomycota)(图5D)。值得注意的是,子囊菌门是注释群落中最丰富的真菌门,其相对丰度在两个样品组之间存在显著差异:在LsM组中,子囊菌门的相对丰度为11.8%,而在LS组中增加到35.7%(图5D)。某些真菌类群在LS中的门水平丰度高于LsM。然而,在同一门内,不同分类水平的某些微生物群的丰度可能相反。例如,属于子囊菌门的真菌属枝孢属,其在LS中的子囊菌门丰度约为LsM的三倍,但在目、科和属水平(枝孢目),LsM中的丰度几乎是LS的两倍。
根据我们的数据,去除宿主序列后,内生微生物分析中干净序列(可用序列)占总序列的比例明显较低。对于内生细菌,宿主DNA去除后可用序列的平均百分比约为21%。相比之下,某些样品的内生真菌分析可用序列数量更为有限,可用序列比例降至总序列的1%以下。尽管我们增加了测序数据量,但获得的信息量仍然有限。这一观察结果表明,简单地扩大数据规模可能无法有效解决限制后续内生群落分析获取有意义生物学信息的潜在限制因素(例如,持续的宿主DNA干扰、目标内生菌生物量低)。未来可能需要应用新技术,如微生物绝对定量,才能揭示更多信息。在真菌多样性研究中,特别是利用高通量扩增子测序(如ITS)表征扩增子序列变体(ASVs)或操作分类单元(OTUs)的研究中,不完整的分类参考数据库仍然是限制准确分类注释和生态解释的关键瓶颈。如本研究所示,大部分真菌扩增子序列变体(ASVs)被归类为“未分类”,这些可能是具有生态意义的类群,会影响群落组成的估计,并阻碍不同实验处理之间真菌群落的比较。
线性判别分析效应大小(LEfSe)和随机森林分析预测的关键内生微生物类群
进行线性判别分析效应大小(LEfSe)以鉴定LsM和LS样品组之间丰度存在显著差异的细菌和真菌类群,并评估其鉴别能力。如分支图所示(图6A、B),每组中都富集了不同的鉴别类群。对于细菌,在多个分类等级上鉴定出分层排列的差异类群:在门水平上,变形菌门和疣微菌门是主要鉴别类群;在纲水平上,α-变形菌纲、γ-变形菌纲和疣微菌纲有助于组间分离;在目水平上,拟杆菌目、鞘脂杆菌目、毛螺菌目、颤螺菌目、根瘤菌目和伯克霍尔德氏菌目是生物标志物;在科水平上,拟杆菌科、鞘脂杆菌科、毛螺菌科、LWQ8科、根瘤菌科、黄色杆菌科、丛毛单胞菌科和草酸杆菌科表现出显著差异富集;在属水平上,LWQ8属、中慢生根瘤菌属-新根瘤菌属-副根瘤菌属-根瘤菌属、慢生根瘤菌属和迟生根瘤菌属被证实为高可信度细菌生物标志物(图6A)。对于真菌,腐质霉属、亡革菌属和伞菌纲成为核心真菌生物标志物,与LsM或LS组相关的分类聚类清晰。这些线性判别分析效应大小(LEfSe)鉴定的类群共同描绘了两个样品组之间微生物群落的分类差异(图6B)。
进一步将随机森林算法应用于微生物丰度,以量化特征重要性并验证关键鉴别类群(图6C、D)。线性判别分析效应大小(LEfSe)突出显示的真菌类群(如腐质霉属和亡革菌属)表现出显著的重要性值(图6B、D)。在特征重要性分析中明确呈现的另一种真菌类群枝孢属,也成为区分样品组的潜在显著类群(图6D)。对于细菌类群,包括中慢生根瘤菌属-新根瘤菌属-副根瘤菌属-根瘤菌属、慢生根瘤菌属以及拟杆菌科和根瘤菌科等科的代表也跻身预测能力的顶级贡献者之列(图6C)。具体而言,腐质霉属和变形菌门相关的扩增子序列变体(ASVs)等类群表现出相对较高的重要性得分(约0.06),表明它们在区分LsM和LS样品方面的关键作用(图6C)。
LEfSe衍生的差异类群与随机森林鉴定的高重要性特征之间的一致性,证实了这些微生物群的生态相关性,验证了它们作为表征LsM和LS样品组独特微生物群落结构的关键生物标志物的地位,这些数据与本研究中的代谢组学数据一致。这种相互对应可能意味着内生群落变化与宿主代谢途径改变之间存在潜在的功能关联,从而为解释不同高海拔环境条件下庐山麻皮土豆的风味差异提供了补充证据。内生群落随海拔升高而变化,它们在宿主植物的养分获取、胁迫耐受性和次级代谢调控中发挥关键作用,最终影响土豆风味。
图6. LsM和LS土豆块茎内生微生物群落的线性判别分析效应大小(LEfSe)和随机森林分析。(A、B)内生微生物类群的LEfSe分支图。这两个分支图可视化了LsM和LS土豆块茎之间存在显著差异的内生细菌(A)和真菌(B)的分层分类,涵盖多个分类等级(门[p],纲[c],目[o],科[f],属[g])。(C、D)内生类群重要性的随机森林分析。通过随机森林算法计算,量化差异内生类群在区分LsM和LS土豆块茎方面的相对重要性。细菌(C)和真菌(D)。