英文题目：Root exudates drive plant-microbiome interactions influencing the quality of cultivated Rheum tanguticum during different growth development stages
中文题目：根系分泌物驱动植物-微生物组互作，影响不同生长发育阶段栽培唐古特大黄的品质
期刊名称：Industrial Crops & Products
影响因子：6.2
作者单位：中国科学院西北高原生物研究所
DOI：https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2025.122157
该研究以唐古特大黄为试验材料，采用非靶向代谢组学、微生物组分析、高效液相色谱（HPLC）定量检测、随机森林回归分析及结构方程建模等方法，结合田间长期栽培试验，系统探究了不同生长发育阶段（生长期Y4、成熟期Y7、衰老期Y10）根系分泌物、根际微生物与生物活性化合物的关联机制。研究发现，生长发育阶段显著驱动根系分泌物组成从有机酸、氨基酸等初级代谢物向胺类、苯及其衍生物等次级代谢物转变；这种转变显著影响根际微生物群落结构与功能，使拜叶林克氏菌科、丙酸杆菌科等有益微生物丰度下降，TRA3-20、假散囊菌科等病原微生物增殖；而有益微生物的减少与病原菌的增加，进一步导致唐古特大黄根部总蒽醌、番泻苷、大黄素等核心生物活性化合物含量在衰老期显著降低。结构方程模型验证了“生长发育阶段→根系分泌物组成转变→微生物群落重构→药用植物品质变化”的级联调控网络，明确了根系分泌物在介导植物-微生物组互作中的核心作用。该研究为唐古特大黄的精准栽培（如优化采收期为Y4）和靶向微生物调控提供了科学依据，推动药用植物栽培从经验模式向科学范式转变。
本研究使用的唐古特大黄样本来自长期栽培后表型稳定的单株后代，确保遗传背景一致性。分别于2013年、2016年和2019年进行温室育苗，随后将幼苗移栽至青海省互助土族自治县的种质资源圃进行栽培试验。每个试验设置5个重复，小区面积为25m2，随机排列。样本采集于2023年7月，分别对应生长4年（生长期）、7年（成熟期）和10年（衰老期）的植株。具体而言，采用Z字形采样法从每个小区随机选取5株生长健康、长势一致的植株作为样本，收集新鲜叶片和叶柄并立即放入无菌袋中。清除杂草和石块后，用灭菌铁锹挖掘5份非根际土（bulk soil）样本（距主根约15cm，土层厚度0-20cm）及整株植株。抖落松散附着的土壤后，用无菌刷子收集紧密附着于根系的土壤作为根际土，同时收集细根。将5个子样本合并为1个混合样本，共收集75个样本（5个植物微生境×3个生长发育阶段×5个重复）。采集的土壤和植物样本迅速装入车载冰箱带回实验室分析：土壤样本（非根际土和根际土）过2mm筛后装入无菌管；植物样本（根、叶柄、叶片）先用无菌水冲洗，再用酒精和次氯酸钠进行表面灭菌，最后用无菌水冲洗3次去除表面残留酒精，转入无菌管。将最后一次冲洗液接种到培养基上，监测菌落生长以验证组织表面无菌性。处理后的样本于-80℃冰箱保存备用。
测定了不同生长发育阶段唐古特大黄根部的10种主要生物活性化合物，包括番泻苷A、番泻苷B、没食子酸、儿茶素、总蒽醌、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸和芦荟大黄素。主成分分析（PCA）和置换多元方差分析（ADONIS）分析显示，不同生长发育阶段唐古特大黄的主要活性化合物存在显著分离，表明生长发育阶段显著影响药用成分含量。随着生长年限增加，生物活性成分含量呈下降趋势：生长期（Y4）和成熟期（Y7）样本的总蒽醌、儿茶素、番泻苷A和番泻苷B含量显著高于衰老期（Y10），且Y4与Y7之间无显著差异；除大黄素甲醚外，大黄素、大黄酚、大黄酸和芦荟大黄素含量在Y7达到峰值，Y10最低（图1）。
图1.唐古特大黄在不同生长发育阶段的生物活性化合物（注：不同字母表示差异具有统计学意义）。
不同生长发育阶段唐古特大黄微生物组的多样性与群落组成
土壤细菌群落的优势类群为γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria，14.6%）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria，14.8%）和热微菌纲（Thermoleophilia，13.7%）；内生细菌群落的优势类群为γ-变形菌纲（26.7%）、放线菌纲（Actinobacteria，26.7%）、α-变形菌纲（18.2%）和梭菌纲（Clostridia，12.0%）。与土壤细菌群落相比，根、叶柄和叶片内生菌中γ-变形菌纲的相对丰度显著增加，放线菌纲和梭菌纲显著富集。土壤真菌群落的主要类群为被孢霉纲（Mortierellomycetes，34.7%）、粪壳菌纲（Sordariomycetes，19.8%）、锤舌菌纲（Leotiomycetes，13.6%）和座囊菌纲（Dothideomycetes，10.0%）；内生真菌群落的主要类群为未分类的子囊菌门（unclassified_p_Ascomycota，24.7%）、锤舌菌纲（18.8%）、银耳纲（Tremellomycetes，16.9%）、粪壳菌纲（14.5%）和座囊菌纲（14.5%）。被孢霉纲在土壤中显著富集，而未分类的子囊菌门在内生真菌中更为丰富。
主坐标分析（PCoA）和PERMANOVA分析表明，在植物水平上，微生物群落组成主要受植物微生境影响（细菌：R2=63%；真菌：R2=51%），其次是生长发育阶段（图2b）。生长发育阶段对地上部和地下部微生物群落的影响因微生境而异：显著影响非根际土、根际土和根内生细菌和真菌群落的变化，但对叶柄和叶片内生细菌和真菌的影响不显著（图2c，2d）。此外，真菌群落的差异程度大于细菌群落。Chao 1指数分析显示，土壤微生物群落的α多样性显著高于植物内生菌；随着生长年限增加，土壤群落的Chao 1指数呈下降趋势，土壤真菌群落尤为明显；而生长发育阶段对植物内生细菌和真菌的Chao 1指数无显著影响（图2a）。
图2.细菌和真菌群落的分布模式。（a）唐古特大黄土壤和植物中微生物群落的操作分类单元（OTU）Chao 1指数，雨云图上方的字母表示不同组间差异的显著性。（b）基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）描述了所有样本的微生物群落分布模式，群落差异通过置换多元方差分析（PERMANOVA）检验。（c）和（d）基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）分别描述了（c）细菌和（d）真菌群落在各个生态微生境中的分布模式，生长发育阶段对群落差异的相对贡献通过非参数多元方差分析（ADONIS）检验。
分析结果表明，细菌和真菌群落的构建均主要受随机过程驱动。进一步量化不同生长阶段各微生境微生物群落组装的5种生态过程发现：生长期和成熟期根际土细菌群落主要受扩散限制影响，衰老期则受扩散限制和异质选择共同影响；所有生长发育阶段根内生细菌群落均受扩散限制和异质选择影响；叶片和叶柄内生细菌群落的组装受扩散限制、漂变和异质选择共同作用。对于真菌群落：随着生长年限增加，扩散限制对非根际土真菌群落组装的影响减弱；根际土受扩散限制和异质选择共同影响，生长期和衰老期扩散限制的影响大于异质选择，成熟期异质选择占主导；植物内生真菌群落的组装受漂变影响更为显著。
不同生长发育阶段唐古特大黄根相关微生物组的功能类群差异
基于FAPROTAX和FUNGuildR的功能预测结果显示，细菌群落主要由“化能营养型”（chemotrophic，22.34%-29.46%）和“好氧化能营养型”（aerobic chemotrophic，20.96%-28.70%）两个功能类群主导，且这两个微生物类群的相对丰度随生长年限增加呈下降趋势。真菌功能预测中，土壤微生物以“内生菌”（Endophyte）类群为主，根内生真菌以“外生菌根”（Ectomycorrhizal）功能类群为主。
进一步分析微生物群落中的有益和病原功能类群发现：细菌群落中，非根际土和根际土与氮循环相关的功能类群随生长年限增加呈下降趋势，而与病原菌相关的细菌呈增加趋势；真菌群落中，丛枝菌根真菌功能类群随生长年限增加呈下降趋势；值得注意的是，非根际土中病原真菌功能类群的相对丰度随生长年限增加而增加，而根际土和根内生中则呈下降趋势。
生长期和成熟期唐古特大黄的微生物网络复杂度更高、正连接更多、稳定性更强。细菌-真菌跨界网络的连通性随生长年限增加呈下降趋势（从14.6降至9.7），表明网络复杂度降低（图3a）；同时，以细菌间关联为主的正连接比例随时间下降，而以细菌-真菌间关联为主的负连接比例在成熟期达到峰值后下降（图3c）。随机删除少量节点对三个网络的稳定性无显著影响（图3d）；随机去除50%类群后，成熟期样本的细菌-真菌跨界网络稳健性最高，衰老期最低（图3e）。此外，生长期和成熟期网络的正内聚性更高，而衰老期网络的负内聚性更强（图3f）。
图3.唐古特大黄不同生长阶段的细菌-真菌跨界网络。（a）共现网络分析显示了生长期、成熟期和衰老期的微生物跨界网络模式。（b）不同生长发育阶段细菌和真菌类群在节点水平拓扑特征上的比较。（c）不同生长发育阶段细菌和真菌类群之间的相互关系或边界。（d）不同生长发育阶段跨界网络的稳定性。（e）稳健性量化为：从不同生长发育阶段的细菌-真菌跨界网络中随机移除50%类群后，剩余类群的比例。（f）不同生长发育阶段细菌-真菌跨界网络群落的内聚性。箱线图上方的不同字母表示差异具有统计学意义。
共现网络中，细菌占比超过50%，表明其在微生物网络中占主导地位，且Y10样本中细菌占比更高；网络核心分析结果一致，衰老期的网络核心数量（细菌：3；真菌：0）显著低于生长期（细菌：13；真菌：2）和成熟期（细菌：15；真菌：8）（图3b）。值得注意的是，尽管跨界网络的模块度指数随生长年限增加呈上升趋势，但共现网络的模块度指数仍相对较低，缺乏明显的功能模块。
通过非靶向分析鉴定了唐古特大黄根系分泌物中的1657种不同代谢物，包括氨基酸及其衍生物（20.64%）、有机酸（12.13%）、苯及其取代衍生物（9.17%）等（图4a）。PCA结果表明，衰老期唐古特大黄的根系分泌物与生长期和成熟期存在显著差异，表明生长发育阶段显著改变了根系分泌物组成（P=0.02）（图4b）。共鉴定出104种差异分泌物（VIP>1，P<0.05），并聚焦于排名前30的显著差异分泌物（图4c）。结果显示，生长期和成熟期根系分泌物以初级代谢物为主，而衰老期以次级代谢物为主：Y4和Y7中GP（糖和多元醇类）显著积累；Y7中有机酸、黄酮类、SL（倍半萜内酯类）和FA（脂肪酸类）等物质丰度较高，包括N-（十二酰基）-4-烯鞘氨醇-1-磷酸胆碱、2E-二十碳烯酸等初级代谢物；Y10中醇类和胺类、苯及其取代衍生物、萜类等次级代谢化合物更易富集，例如广藿香醇、苯甲酸苄酯和（2E,4E）-11-甲氧基-3,7,11-三甲基十二碳-2,4-二烯酸的含量较高（图4d）。
图4.唐古特大黄不同生长阶段根系分泌物的代谢组学分析。（a）根系分泌物的组成。（b）主成分分析（PCA）显示了不同生长发育阶段根系分泌物的代谢物谱差异，群落差异通过非参数多元方差分析（ADONIS）检验。（c）曼哈顿图展示了不同生长阶段的显著差异代谢物：每个三角形代表差异代谢物（变量重要性投影值VIP>1且P<0.05）；每个正方形代表差异最显著的前30种代谢物；每个圆点代表不同生长阶段无显著差异的代谢物。（d）热图聚类和变量重要性投影（VIP）评分显示，根系分泌物中前30种代谢物在不同生长阶段存在统计学显著差异（**P<0.01；***P<0.001）。
对前30种差异分泌物进行KEGG通路富集分析发现，这些差异分泌物参与多种代谢途径，包括有机体系统、代谢、人类疾病、细胞过程和环境信息处理（图5a）；其中抗坏血酸和醛酸代谢、嘧啶代谢、代谢途径、碳代谢和辅因子生物合成5个代谢途径的生物标志物代谢物显著富集（图5b）。进一步分析鉴定出4种关键差异生物标志物代谢物：L-古洛糖酸-1,4-内酯、D-核酮糖-1,5-二磷酸、脱氧尿苷和CDP。其中，L-古洛糖酸-1,4-内酯和脱氧尿苷在生长期和衰老期的含量显著高于成熟期，D-核酮糖-1,5-二磷酸在这两个时期的含量显著低于成熟期，CDP在生长期丰度较高（图5c）。
图5.显著差异代谢物的功能分析。（a）唐古特大黄不同生长阶段显著差异代谢物的KEGG通路分类。（b）显著差异代谢物KEGG类别富集率的气泡图。（c）该图谱展示了唐古特大黄中差异显著的KEGG通路分类，不同颜色的正方形代表不同的代谢通路。KEGG：京都基因与基因组百科全书。箱线图上方的不同字母表示差异具有统计学意义。
随机森林建模分析结果表明，脂质、有机酸、醇类和胺类、苯及其取代衍生物、醌类等分泌物显著影响细菌群落的α和β多样性，其中FFA（16:1）和苯甲酸苄酯分别是影响α和β多样性的最重要预测因子（图6a）；对于真菌群落，脂质、黄酮类、核苷酸及其衍生物对α和β多样性的影响更为显著，其中[5-（3,5-二羟基-7-甲氧基-4-氧代-4H-色烯-2-基）-2-羟苯基]氧杂烷磺酸和黄酮醇-3-O-D-木糖基半乳糖苷是影响根际真菌群落α和β多样性的最关键预测因子（图6a）。
相关性分析显示，18个细菌科（包括病原菌、Gemmatimonadaceae、Pedosphaeraceae、丙酸杆菌科Propionibacteriaceae、TRA3-20、根瘤菌目未分类类群Rhizobiales_Incertae_Sedis、A21b和拜叶林克氏菌科Beijerinckiaceae）与差异根系分泌物显著相关（图6b）；真菌群落中，丛枝菌根真菌、病原真菌以及21个真菌科（如锤舌菌目未分类科Helotiales_fam_Incertae_sedis、假散囊菌科Pseudeurotiaceae、Leptosphaeriaceae和Didymellaceae）也与差异根系分泌物显著相关（图6c）。进一步研究发现，芽单胞菌科、鞘氨醇单胞菌科、拜叶林克氏菌科、分枝杆菌科Mycobacteriaceae、丙酸杆菌科、根瘤菌科Rhizobiaceae、Leptosphaeriaceae和Didymellaceae等微生物科主要由有益微生物组成，其相对丰度随时间显著下降；而Pedosphaeraceae、TRA3-20、Helotiales_fam_Incertae_sedis和假散囊菌科等主要由病原微生物组成，其相对丰度随时间增加。线性回归分析显示，根系分泌物（如苯甲酸苄酯、广藿香醇）与有益微生物科呈显著负相关，与病原微生物科呈显著正相关。这些结果表明，随着生长发育阶段的变化，根系分泌物从初级代谢物向次级代谢物的转变导致根际微生物组成发生显著变化，抑制有益微生物同时促进病原微生物。
有益和病原微生物、高丰度科与唐古特大黄10种活性成分含量的关联分析显示，与不同根系分泌物显著相关的微生物科也与活性成分含量显著相关，而高丰度但与差异根系分泌物无显著相关的微生物类群通常与活性成分含量无显著相关性。病原菌主要与活性成分呈负相关，有益细菌倾向于呈正相关，有益真菌类群也主要与活性成分含量呈正相关。这进一步表明，根系分泌物驱动的微生物群落变化在调控唐古特大黄品质中起关键作用，有益微生物减少和病原微生物增加是导致有效化合物含量降低的主要因素。随机森林分析表明，细菌中的芽单胞菌科和Pedosphaeraceae，以及真菌中的Leptosphaeriaceae和壶菌门Chytridiomycota是影响品质的最显著因素（图6d）。结构方程模型分析结果显示，生长发育阶段对根系分泌物有显著负向影响（b=-0.65），对微生物（尤其是细菌多样性）有正向影响（b=0.94）（图6e）；此外，根系分泌物直接显著影响细菌和真菌多样性（细菌多样性：b=0.42；真菌多样性：b=0.59），这些微生物进一步对唐古特大黄品质产生显著影响（图6e）。
图6.主要根系分泌物、微生物类群与生物活性化合物的关联分析。（a）基于随机森林回归分析，预测排名前30的差异代谢物对唐古特大黄主要微生物类群的影响。（b）和（c）分别为排名前30的差异代谢物与细菌群落、真菌群落的共现网络。（d）基于随机森林回归分析，预测主要微生物类群对唐古特大黄主要生物活性化合物的影响（显著影响因素以星号标注：*P<0.05；**P<0.01）。（e）结构方程模型展示了主要根系分泌物、微生物类群与生物活性化合物之间的关系，箭头旁的数值代表标准化路径系数。
本研究探讨了唐古特大黄不同生长发育阶段根系分泌物的时空变化，揭示了其在介导根际微生物招募和药用植物品质形成中的关键作用。结果表明，生长期和成熟期，根系分泌的有机酸和氨基酸增加，吸引更多固氮和促生微生物，有利于生物活性化合物积累；相反，衰老期根系分泌物中胺类、苯类等次级代谢物浓度升高，这种转变抑制有益微生物类群，促进潜在病原菌增殖，最终导致唐古特大黄品质下降。我们提出，尽管植物根系在衰老期分泌的这些次级代谢物增强了抗逆能力，但这种适应策略的副作用可能破坏根际微生态平衡，形成“微生物组-药用植物品质”的负反馈调控。总之，本研究阐明了根系分泌物、微生物和药用植物品质之间的复杂关系，为调控和利用这些因素提高药用植物品质提供了理论基础。Jianan Li, Bo Wang, Huiyuan Ma, Xue Yang, Tao Wang, Guoying Zhou,Root exudates drive plant-microbiome interactions influencing the quality of cultivated Rheum tanguticum during different growth development stages,Industrial Crops and Products,Volume 237,2025,122157,ISSN 0926-6690,https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2025.122157.