本研究所用两种大球盖菇菌株MD128（CGMCC 5.2268）和浙江瑞新19（CGMCC 41582）均为非商业菌株，由中国浙江省嘉兴市农业科学院提供。MD128是ZJR19红色棕褐色菌株自然突变产生的黄色菌盖变种。将菌丝体接种于由以下主要原料配制的固体培养基上：稻草（RS）、桑枝（MB）、葡萄藤（GV）、果胶渣（RP）或混合木屑（MWC）。培养基由83%的主要原料，辅以10%稻壳、5%麸皮、1%石灰和2%红糖组成。培养在25℃下进行，相对湿度维持在65%至70%，直至菌丝完全覆盖培养基。随后覆上一层覆土，进行低温处理以诱导原基形成和子实体发育。子实体在相同条件下采集三个不同发育阶段（S1（Stage I）：芽期；S2（Stage II）：采收期；S3（Stage III）：开伞期）。在第二阶段，将菌盖、菌肉和菌柄分离。所有样品迅速于液氮中冷冻，并储存于-80°C以备后续分析。代谢组学和转录组学分析及下游实验均使用三个生物学重复。

大球盖菇的独特风味是其吸引消费者的关键因素，且在不同发育阶段有显著变化。使用电子舌检测三个发育阶段的味觉变化（图1A，B）。结果显示，随着子实体成熟，其鲜味和甜味特征发生变化。值得注意的是，在菌盖展开阶段（菌盖从闭合状态逐渐展开至孢子成熟的生长阶段），大球盖菇的鲜味和甜味显著下降（图1B）。

为了阐明大球盖菇子实体中的代谢物变化，收集了三个不同发育阶段的标本：第一阶段S1（芽期）、第二阶段S2（采收期）和第三阶段S3（开伞期）（图1A）。使用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS/MS）分析了九个样品，每个发育阶段三个样品。代谢组学数据的主成分分析（PCA）显示，三个子实体阶段的样品可以通过前两个主成分PC1和PC2明显区分，分别占总方差的50.4%和24.6%（图2A）。共鉴定出2501种代谢物，分为23类，包括氨基酸及其代谢物（30.6%）和有机酸及其衍生物（12%）（图2B）。维恩图分析显示，比较差异表达基因（DEMs）有大量重叠，S2与S1、S3与S1以及S3与S2比较中分别鉴定出309、330和143个DEMs。此外，在S2与S1、S3与S1以及S3与S2比较中分别检测到176、142和103个独特的DEMs。

随后，KEGG基于数据库的DEMs分析以鉴定代谢通路富集情况。根据p值对数据进行筛选，选取前20条显著富集的通路进行分析。这些通路包括氨基酸生物合成、Asp和Glu代谢、TCA循环、淀粉和蔗糖代谢以及戊糖磷酸途径（图2C）。为了阐明子实体发育动态，使用k均值聚类分析根据积累模式将差异积累代谢物（DAMs）分为六个不同的簇（CI-CVI）。簇CI在S2阶段达到代谢物积累峰值，其中S1阶段的代谢物水平高于S3阶段，涉及缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）的生物合成、苯丙氨酸（Phe）代谢及精氨酸（Arg）代谢途径。簇CII在发育过程中代谢物水平下降，与丙氨酸（Ala）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）代谢、能量代谢途径及TCA循环相关。主要富集于苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）的生物合成及精氨酸/脯氨酸（Arg/Pro）代谢。簇CIV显示S1-S2阶段变化最小，但S3阶段显著升高，与半乳糖和嘌呤代谢相关。簇CV显示S1-S2阶段代谢物下降，随后在S3阶段部分恢复，涉及脂质和氮代谢。簇CVI在S2阶段达到峰值，与叶酸代谢相关。这些代谢通路可能调节子实体发育过程中的理化变化，尤其是风味物质和营养成分的生成。

在此基础上，进一步分析了氨基酸的积累和变化。结果显示，大球盖菇子实体中14种氨基酸的含量在I-III阶段变化显著（图2D）。从I阶段到III阶段，Asn、Asp和Glu浓度显著下降，这与大球盖菇鲜味谱的记录变化一致（图1B）。

氨基酸是通过糖酵解和三羧酸循环由葡萄糖合成的。在之前的KEGG分析中，观察到TCA循环、淀粉和蔗糖代谢以及磷酸戊糖途径出现富集现象（图2C）。因此，本研究进一步探究了TCA循环在大球盖菇氨基酸生物合成中的作用。基于其他物种的相关证据以及大球盖菇转录组和代谢组的数据，本研究提出了大球盖菇中氨基酸的生物合成途径（图4A）。总共鉴定出转录组中编码44种酶的52个单基因，以及代谢组中参与氨基酸合成的22种氨基酸（图4B）。本研究采用皮尔逊相关性分析，探究了在三个发育阶段中浓度变化显著（R绝对值超过0.8）的候选基因表达水平与氨基酸之间的关系。结果显示，编码柠檬酸合酶（SrCS）的SrGene05986和SrGene06984、编码ATP柠檬酸（前体）裂解酶（SrACLY）的SrGene09568、编码丙酮酸羧化酶（SrPC）的SrGene09212、编码延胡索酸水合酶（SrfumC）的SrGene04166，以及编码苹果酸脱氢酶（SrMDH2）的SrGene01929（这些基因均参与TCA循环）与至少10种氨基酸呈显著正相关，与L-天冬氨酸和L-谷氨酸呈显著负相关。

对TCA循环中关键基因的表达分析显示，与ZJR19相比，MD128中这6个候选基因的表达水平有所升高，其中SrGene05986的表达量增加了21.5倍（图4C）。研究人员克隆了SrGene05986的编码序列（命名为SrCS）并筛选用于后续研究。柠檬酸合酶是TCA循环中的限速酶，草酰乙酸（OAA）和乙酰辅酶A（A-CoA）通过柠檬酸合酶反应转化为柠檬酸。在低温处理下，两个品种中SrCS的表达量均显著下降（图4D）。在低温条件下生长的子实体中，柠檬酸含量显著增加（图4E）。在子实体生长发育过程中，柠檬酸含量显著下降。本研究进一步分析了不同基质配方栽培的子实体中SrCS的表达情况。同样，稻草和果胶渣组（天冬氨酸和谷氨酸产量较高）中SrCS的表达量显著低于桑树枝和葡萄枝组。这表明SrCS的表达与天冬氨酸和谷氨酸的含量呈负相关。

图4.大球盖菇中涉及SrCS的氨基酸生物合成途径。（A）大球盖菇中氨基酸生物合成途径的示意图。（B）参与氨基酸生物合成途径的差异表达基因分析。颜色从红色到蓝色的变化表示从高到低。（C）大球盖菇不同品种中6个关键候选基因的表达情况。（D）不同温度处理下，大球盖菇两个品种中SrCS的表达分析。*表示p<0.05，**表示p<0.01；（E）不同温度处理下，子实体中的柠檬酸含量情况。

为了探究SrCS的亚细胞定位，本研究构建了35S:SrCS-GFP融合质粒，并将其瞬时表达于烟草叶片中。共聚焦显微镜观察表明，SrCS的强绿色荧光蛋白（GFP）信号与线粒体的mCherry信号（Mt-RK）共定位，这表明SrCS定位于线粒体（图5A，B）。这一结果表明SrCS与线粒体TCA循环相关。接下来，将SrCS过表达载体转化到烟草中，并使用高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）测定烟草中的氨基酸含量。结果表明，与野生型（WT）相比，SrCS的过表达导致大多数氨基酸的含量显著增加。具体而言，与野生型相比，过表达SrCS的植株（OE-SrCS）中亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸和色氨酸的含量显著更高。相反，与野生型相比，OE-SrCS中天门冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺的含量显著更低（图5C），这与代谢转录组关联分析的结果一致。这一发现证实了SrCS在大球盖菇的氨基酸生物合成中起着重要作用，SrCS有助于鲜味氨基酸的合成。

图5. SrCS在线粒体TCA循环和氨基酸合成中的功能。（A）将SrCS的全长编码序列（CDS）插入pCAMBIA1300中构建的表达载体。（B）使用35S:SrCS-sGFP融合质粒以及线粒体标记物对SrCS进行亚细胞定位研究，该标记物在本氏烟叶片中瞬时表达，比例尺=30微米。（C）OE-SrCS株系和野生型中氨基酸含量的热图。颜色从红色到蓝色的变化表示氨基酸含量从高到低。数值表示为平均值±标准差，n=3。