miR1832启动子区的A/G突变与种子休眠表型差异显著相关
为探究miR1832介导小麦种子休眠表型差异的分子基础，本研究从强休眠品种“WTB”、“HMC21”和弱休眠品种“ZY9507”、“J411”中克隆了miR1832上游1000bp的启动子序列及前体序列。结构分析显示，miR1832具有典型的茎环结构；序列比对发现，强休眠品种与弱休眠品种的miR1832启动子和前体区存在两个单核苷酸多态性突变。启动子顺式作用元件预测分析表明，miR1832启动子区-670bp处的A→G突变，可能导致弱休眠品种“J411”和“ZY9507”中该位点的Dof蛋白结合基序缺失（图2D）；而前体区+156bp处的T→C突变未改变其茎环结构。
为验证miR1832启动子区-670bp处的A/G突变是否影响种子休眠表型，本研究基于该突变开发了酶切扩增多态性序列标记（CAPS-1832）（图2E），并利用该标记对160个不同休眠水平的小麦品种进行基因分型，将该标记的两个等位基因命名为1832-A和1832-G。U检验结果显示，1832-A和1832-G基因型小麦品种的发芽指数存在极显著差异（图2F），其中1832-A等位基因与低发芽指数（强休眠、抗穗发芽）显著关联，1832-G等位基因与高发芽指数（弱休眠、易穗发芽）显著关联（P<0.01）。为进一步验证该A/G突变与种子休眠表型的关联性，本研究检测了10个1832-A基因型和10个1832-G基因型小麦品种中miR1832的表达量，结果显示1832-A基因型品种中miR1832的表达量显著高于1832-G基因型品种。综上，miR1832启动子区的A/G突变与小麦种子休眠表型差异显著相关，其中A等位基因与强休眠性和抗穗发芽性关联。
为探究与强休眠、抗穗发芽相关的1832-A优异性等位基因在小麦育种中的利用情况，本研究利用CAPS-1832标记对124个小麦地方品种和245个改良品种进行基因分型。结果显示，在124个地方品种中，1832-A等位基因的分布频率达76.6%（95个），显著高于1832-G等位基因（23.4%，29个）；而在245个改良品种中，仅4个品种（1.6%）携带1832-A等位基因，其余241个品种（98.4%）均为1832-G等位基因（图2G）。以上结果表明，1832-A等位基因在现代小麦育种中未得到充分利用，可作为分子设计育种中改良小麦穗发芽抗性的候选等位基因。
图2.MiR1832正调控小麦种子休眠。（A）“Fielder”、miR1832过表达株系（pre-miR1832-OE）和miR1832沉默株系（miR1832-STTM）小麦种子吸胀3天的发芽率（GP），数值为平均值±标准差（n=3）；采用Student’s t检验分析统计显著性（**P<0.01）。（B）“Fielder”、pre-miR1832-OE和miR1832-STTM小麦种子吸胀3天的萌发表型。（C）“Fielder”、pre-miR1832-OE和miR1832-STTM小麦穗吸胀5天的萌发表型。（D）弱休眠品种（“ZY9507”、“J411”）与强休眠品种（“WTB”、“HMC21”）的miR1832序列比对；青色方框代表Dof结合位点，红色碱基代表突变位置。（E）采用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测miR1832的酶切扩增多态性序列（CAPS）标记1832。（F）160个小麦品种（160WVs）中携带1832-A和1832-G等位基因的种子在不同环境下（22GI5-HF、22GI5-SZ、22GI5-HB、22GI5-GH、23GI5-HF、23GI5-HB）的发芽指数（GI）差异；1832-A/G：对应miR1832启动子-670bp处A/G核苷酸突变的CAPS标记1832等位基因；采用Student’s t检验分析统计显著性（*P<0.05，**P<0.01）。（G）地方品种和改良品种中miR1832的等位基因频率分布。
TaDof-2D直接结合miR1832启动子的A等位基因位点并抑制其转录
强休眠品种“WTB”和“HMC21”的miR1832启动子区-670bp处的A位点被预测为Dof转录因子的结合位点。为筛选能结合该位点的上游转录因子，本研究扩增了包含A和G等位基因的、-670bp位点两侧各45bp的序列（分别命名为miR1832-A和miR1832-G），并将miR1832-A克隆至pAbAi载体构建诱饵系统，进行酵母单杂交文库筛选，共鉴定出35个阳性克隆，其中包含3个Dof转录因子：TaDof-2D（TraesCS2D02G100300）、TaDof-3A（TraesCS3A02G180600）和TaDof-4D（TraesCS4D02G285100）。对常温和低温处理的“WTB”种子进行转录分析，结果显示TaDof-2D的表达受低温显著上调，而TaDof-3A和TaDof-4D的表达无显著变化。
酵母单杂交实验表明，TaDof-2D、TaDof-3A和TaDof-4D均可结合miR1832-A序列，但无法结合miR1832-G序列（图3A、B）。双荧光素酶（LUC）报告基因实验进一步证实了等位基因特异性调控：仅TaDof-2D可显著降低含A等位基因的miR1832启动子的转录活性，而TaDof-2D、TaDof-3A和TaDof-4D均无法调控含G等位基因的miR1832启动子的转录活性（图3C-E）。此外，含A等位基因的miR1832启动子转录活性显著高于含G等位基因的启动子（图3E），这与1832-A基因型小麦品种中miR1832高表达的结果一致。为验证该调控作用的直接性，本研究进行了电泳迁移率变动分析（EMSA），结果显示仅TaDof-2D可特异性结合包含A等位基因的5”-AAGGC-3”基序，而TaDof-2D、TaDof-3A和TaDof-4D均无法结合包含G等位基因的miR1832-G基序（图3F）。综上，TaDof-2D可直接结合miR1832启动子的A等位基因位点，抑制其表达。结合低温处理可上调“WTB”种子中TaDof-2D的表达、下调miR1832表达的结果，本研究推测低温通过上调TaDof-2D的表达，抑制miR1832的转录，进而诱导小麦种子休眠解除。
图3. TaDof-2D抑制miR1832转录。（A）酵母单杂交实验（Y1H）显示，TaDof-2D、TaDof-3A和TaDof-4D可结合含A等位基因的miR1832启动子；SD/-Leu：缺亮氨酸合成缺陷培养基；AbA：金担子素A。（B）酵母单杂交实验显示，TaDof-2D、TaDof-3A和TaDof-4D无法结合含G等位基因的miR1832启动子。（C）双荧光素酶（LUC）报告基因实验所用的报告基因和效应元件结构。（D-E）瞬时双荧光素酶报告基因实验显示，TaDof-2D抑制含A等位基因的miR1832启动子转录活性；上图为烟草叶片中的LUC信号，下图为LUC/海肾荧光素酶（REN）比值；数值为平均值±标准差（n=3）；采用Student’s t检验分析统计显著性（**P<0.01）；ns：无显著差异。（F）电泳迁移率变动分析（EMSA）检测TaDof-2D与miR1832启动子中Dof结合基序AAGGC的结合能力；结合反应中添加10倍和50倍未标记探针作为竞争物；miR1832-A：含A等位基因的miR1832启动子片段；miR1832-G：含G等位基因的miR1832启动子片段；GST：谷胱甘肽S-转移酶。
为验证TaDof-2D对小麦种子休眠的调控作用，本研究在1832-G基因型品种“Fielder”和1832-A基因型品种“WTB”中过表达TaDof-2D的编码序列，分别获得3个“Fielder”背景的过表达株系（Dof-2D-G-OE#2、Dof-2D-G-OE#4、Dof-2D-G-OE#5）和3个“WTB”背景的过表达株系（Dof-2D-A-OE#3、Dof-2D-A-OE#5、Dof-2D-A-OE#6）。萌发实验表明，与野生型“WTB”相比较，Dof-2D-A-OE#3/5/6株系的发芽率显著升高（休眠性降低）；而Dof-2D-G-OE#2/4/5株系与野生型“Fielder”的发芽率无显著差异（图4A-F）。此外，本研究在1832-G基因型品种“J411”中获得了TaDof-2D的甲基磺酸乙酯诱变突变体（dof-2d），该突变体在第382位氨基酸处发生G/A单核苷酸突变，导致翻译提前终止；萌发实验显示，dof-2d突变体与野生型“J411”的发芽率无显著差异（图4G-I）。表达检测表明，与野生型“WTB”相比，Dof-2D-A-OE#3/5/6株系中miR1832的表达量显著下调；而Dof-2D-G-OE#2/4/5株系与“Fielder”、dof-2d突变体与“J411”中miR1832的表达量均无显著差异。实时qRT-PCR分析了TaDof-2D和miR1832在“WTB”根、茎、叶、穗和种子中的表达模式，结果显示TaDof-2D在根和茎中表达量较高，在叶、穗和种子中表达量较低；而miR1832的表达模式则与之相反。以上结果证实，TaDof-2D通过特异性结合miR1832启动子的A等位基因位点抑制其转录，进而降低小麦种子的休眠性。
图4. TaDof-2D通过结合miR1832启动子的A位点调控小麦种子休眠。（A）“WTB”和Dof-2D-A-OE#3/5/6种子吸胀3天的萌发表型。（B）“WTB”和Dof-2D-A-OE#3/5/6穗吸胀5天的萌发表型。（C）“WTB”和Dof-2D-A-OE#3/5/6种子的发芽率，数值为平均值±标准差（n=3）；采用Student’s t检验分析统计显著性（**P<0.01）。（D）“Fielder”和Dof-2D-G-OE#2/4/5种子吸胀3天的萌发表型。（E）“Fielder”和Dof-2D-G-OE#2/4/5穗吸胀5天的萌发表型。（F）“Fielder”和Dof-2D-G-OE#2/4/5种子的发芽率，数值为平均值±标准差（n=3）。（G）“J411”和dof-2d种子吸胀3天的萌发表型。（H）“J411”和dof-2d穗吸胀5天的萌发表型。（I）“J411”和dof-2d种子的发芽率，数值为平均值±标准差（n=3）；ns，无显著差异。
为鉴定miR1832的靶标基因，本研究结合转录组测序结果与psRNATarget靶标预测，筛选出3个潜在靶标基因：乙烯响应转录因子基因TaERF-1D（TraesCS1D02G221500）、NAC转录因子基因TaNAC-4A（TraesCS4A02G219700）和细胞色素P450基因TaP450-7A（TraesCS7A02G455300）。表达分析显示，与miR1832相反，这3个基因在低温处理的“WTB”种子中均显著上调表达。本研究进一步检测了这3个基因在新鲜收获的miR1832过表达株系、沉默株系和野生型“Fielder”种子中的表达模式，结果显示与“Fielder”相比，TaP450-7A在miR1832过表达株系中显著下调表达，在miR1832沉默株系中显著上调表达；而TaERF-1D和TaNAC-4A在过表达、沉默株系与野生型中的表达量均无显著差异。以上结果表明，TaP450-7A可能是miR1832的关键靶标基因。本研究通过5'端cDNA快速扩增技术，定位了miR1832对TaP450-7A mRNA的切割位点（图5A）。为进一步在体内验证miR1832对TaP450-7A的调控作用，本研究对TaP450-7A进行同义突变，获得miR1832抗性版本（mTaP450-7A）（图5B），该突变体可避免被miR1832靶向切割。烟草叶片瞬时表达的双荧光素酶实验表明，miR1832的表达可显著抑制TaP450-7A-LUC报告基因的信号积累，而对mTaP450-7A-LUC报告基因的活性无显著抑制作用（图5C-E）。qRT-PCR检测显示，1832-A基因型小麦品种中TaP450-7A的表达量显著低于1832-G基因型品种。以上结果证实，miR1832可在体内直接靶向切割TaP450-7A的mRNA。
为验证TaP450-7A对小麦种子休眠的调控作用，本研究在“Fielder”中过表达TaP450-7A，获得3个过表达株系（P450-7A-OE#3、P450-7A-OE#6、P450-7A-OE#7）。与“Fielder”相比，3个过表达株系中TaP450-7A的表达量均显著上调；萌发实验表明，过表达株系的发芽率（P450-7A-OE#3为98%、P450-7A-OE#6为97%、P450-7A-OE#7为100%）显著高于“Fielder”（85%）（图5F-H）。此外，本研究在“J411”中获得了TaP450-7A的甲基磺酸乙酯诱变突变体（p450-7a），该突变体在第19位氨基酸处发生G/A单核苷酸突变，导致翻译提前终止；萌发实验显示，p450-7a突变体的发芽率（50%）显著低于野生型“J411”（90%）（图5I-K）。综上，TaP450-7A负调控小麦种子休眠，而miR1832正调控小麦种子休眠，证实了二者间的靶向调控关系。
为探究miR1832与TaP450-7A的遗传调控关系，本研究构建了miR1832与TaP450-7A的过表达杂交株系（pre-miR1832-OE#4/P450-7A-OE#7）。萌发实验表明，杂交株系可逆转miR1832过表达株系的强休眠表型，使种子休眠水平恢复至野生型水平（图5L、M）。此外，本研究检测了不同TaDof-2D转基因小麦品种中TaP450-7A的表达量，结果显示与野生型“WTB”相比，Dof-2D-A-OE#3/5/6株系中TaP450-7A的表达量显著上调；而Dof-2D-G-OE#2/4/5株系与“Fielder”、dof-2d突变体与“J411”中TaP450-7A的表达量均无显著差异。以上结果表明，在Dof-2D-A-OE株系中，TaDof-2D通过特异性结合miR1832启动子的A等位基因位点，抑制miR1832的表达，进而上调TaP450-7A的表达，最终降低小麦种子的休眠。
图5. miR1832的靶标验证及功能分析。（A）5′-cDNA快速扩增（5′-RACE）实验显示miR1832介导的TaP450-7A切割位点；黄色、蓝色和灰色方框分别代表非翻译区（UTR）、外显子和内含子。（B）通过同义突变获得miR1832抗性版本（mTaP450-7A）的示意图。（C）双荧光素酶（LUC）报告基因实验所用的报告基因和效应元件结构；CaMV35S，花椰菜花叶病毒35S启动子；Nos，胭脂碱合成酶终止子。（D）转染报告载体和效应/报告载体的本氏烟草组织中的LUC活性。（E）本氏烟草中miR1832与TaP450-7A靶标关系的LUC实验验证，数值为平均值±标准差（n=3）。（F）“Fielder”和P450-7A-OE#3/6/7种子吸胀3天的萌发表型。（G）“Fielder”和P450-7A-OE#3/6/7穗吸胀5天的萌发表型。（H）“Fielder”和P450-7A-OE#3/6/7种子的发芽率，数值为平均值±标准差（n=3）。（I）“J411”和p450-7a种子吸胀3天的萌发表型。（J）“J411”和p450-7a穗吸胀5天的萌发表型。（K）“J411”和p450-7a种子的发芽率，数值为平均值±标准差（n=3）。（L）“Fielder”、pre-miR1832-OE#4和pre-miR1832-OE#4/P450-7A-OE#7种子吸胀3天的萌发表型，数值为平均值±标准差（n=3）（M）“Fielder”、pre-miR1832-OE#4和pre-miR1832-OE#4/P450-7A-OE#7种子的发芽率，数值为平均值±标准差（n=3）；采用Student’s t检验分析统计显著性（**P<0.01）。ns，无显著差异。
TaDof-2D-miR1832-TaP450-7A调控模块通过调控α-淀粉酶活性及脱落酸、赤霉素通路介导低温诱导的种子休眠解除
小麦种子发育中后期遭遇低温可诱导晚熟α-淀粉酶基因表达，进而在高湿条件下促进种子萌发；且赤霉素和脱落酸可通过拮抗作用调控晚熟α-淀粉酶基因的表达。本研究推测，脱落酸、赤霉素和α-淀粉酶（包括晚熟α-淀粉酶）共同参与低温诱导的“WTB”种子休眠解除。表达分析显示，与常温处理相比，低温处理的“WTB”种子中6个晚熟α-淀粉酶基因（TraesCS6A02G334200，TraesCS6B02G349700，TraesCS6B02G349500，TraesCS6B02G364900，TraesCS6B02G349800，TraesCS6B02G364800）表达显著上调，2个α-淀粉酶抑制基因（TaCM1-7D、TaCM2-7B）表达显著下调；同时，4个赤霉素信号通路基因（TaGID1-1B、TaGID1-1D、TaGASR7-7B、TaGASR7-7D）和2个脱落酸分解代谢基因（TaABA8'OH2-5B、TaABA8'OH2-5D）表达显著上调，2个脱落酸信号通路基因（TaABI5-3B、TaABI5-3D）表达显著下调；实时qRT-PCR验证了这些基因的表达模式。生理指标检测显示，与常温处理相比，低温处理的“WTB”种子中GA1、GA3含量和α-淀粉酶活性显著升高，脱落酸含量显著降低（图1D-F）。综上，小麦种子发育中后期遭遇低温，可通过调控晚熟α-淀粉酶的积累及赤霉素、脱落酸的生物合成、分解代谢与信号通路，诱导种子休眠解除。
为进一步验证TaDof-2D-miR1832-TaP450-7A调控模块是否通过影响赤霉素、脱落酸信号通路关键基因的表达，介导低温诱导的种子休眠解除，本研究测定了吸胀24h的miR1832过表达株系（pre-miR1832-OE#4）、TaP450-7A过表达株系（P450-7A-OE#7）和野生型“Fielder”种子中的赤霉素、脱落酸含量及α-淀粉酶活性。检测到小麦种子中存在两条主要的赤霉素生物合成通路：非13-羟化通路（包括GA15、GA9、GA24、GA4）和早期13-羟化通路（包括GA53、GA44、GA19、GA20、GA1、GA5、GA3）。结果显示，与“Fielder”相比，TaP450-7A过表达株系中早期13-羟化通路的关键前体物质（GA53、GA44、GA19、GA20）和活性产物（GA1、GA3）含量显著升高，而miR1832过表达株系中上述物质含量显著降低（图6A）。此外，TaP450-7A过表达株系中脱落酸含量显著降低、α-淀粉酶活性显著升高，而miR1832过表达株系则呈现相反的趋势（图6B、C）。以上结果为miR1832-TaP450-7A通过调控脱落酸/赤霉素平衡调控小麦种子休眠提供了有力证据。
本研究进一步分析了吸胀24h的pre-miR1832-OE#4、P450-7A-OE#7和“Fielder”种子中脱落酸、赤霉素通路相关基因的表达模式。结果显示，与“Fielder”相比，pre-miR1832-OE#4种子中赤霉素生物合成基因（TaGA20ox1）、赤霉素信号通路基因（TaGASR7-7B、TaGASR7-7D、TaGID1-1B、TaGID1-1D）和脱落酸分解代谢基因（TaABA8'OH-5B、TaABA8'OH-5D）的表达量显著下调，而脱落酸信号通路基因（TaABI5-3B、TaABI5-3D）的表达量显著上调；同时，α-淀粉酶基因TaAmy1-6B的3个同源基因表达量显著下调，α-淀粉酶抑制基因（TaCMI-7D、TaCM2-7B）表达量显著上调。而P450-7A-OE#7种子中上述基因的表达模式与pre-miR1832-OE#4完全相反。综上，TaDof-2D-miR1832-TaP450-7A调控模块通过调控α-淀粉酶活性及赤霉素、脱落酸信号通路，介导低温诱导的小麦种子休眠解除。
图6. miR1832-TaP450-7A模块通过影响α-淀粉酶活性及脱落酸、赤霉素通路促进低温诱导的种子休眠解除。（A）“Fielder”、pre-miR1832-OE#4和P450-7A-OE#7种子吸胀24h后的赤霉素含量，图示为两条主要的赤霉素生物合成通路：非13-羟化通路（包括GA15[赤霉素A15]、GA9[赤霉素A9]、GA24[赤霉素A24]、GA4[赤霉素A4]）和早期13-羟化通路（包括GA53[赤霉素A53]、GA44[赤霉素A44]、GA19[赤霉素A19]、GA20[赤霉素A20]、GA1[赤霉素A1]、GA5[赤霉素A5]、GA3[赤霉素A3]）；FW：鲜重；ox：氧化酶；ND：未检测到；数值为平均值±标准差（n=3）。（B-C）“Fielder”、pre-miR1832-OE#4和P450-7A-OE#7种子吸胀24h后的脱落酸含量和α-淀粉酶活性；FW：鲜重；数值为平均值±标准差（n=3）。（D-F）“Fielder”、pre-miR1832-OE#4和P450-7A-OE#7种子吸胀24h后α-淀粉酶生物合成及脱落酸、赤霉素信号通路关键基因的表达水平；基因ID：TraesCS5D02G038800（TaNCED1）、TraesCS5B02G236500（TaABA8'OH-5B）、TraesCS5D02G244900（TaABA8'OH-5D）、TraesCS3B02G404400（TaABI5-3B）、TraesCS3D02G364900（TaABI5-3D）、TraesCS3D02G393900（TaGA20ox1）、TraesCS7B02G115300（TaGASR7-7B）、TraesCS7A02G208100（TaGASR7-7A）、TraesCS1B02G265900（TaGID-1B）、TraesCS1D02G254500（TaGID-1D）、TraesCS6B02G349700（TaAmy1-6B）、TraesCS6B02G349800（TaAmy1-6B）、TraesCS6B02G364800（TaAmy1-6B）、TraesCS7D02G168000（TaCM1-7D）、TraesCS7B02G072000（TaCM2-7B）；数值为平均值±标准差（n=3）。（G）赤霉素和脱落酸生物合成、代谢及信号转导通路中关键基因的作用位置示意图。采用Student’s t检验分析统计显著性（*P<0.05，**P<0.01）；ns，无显著差异。