CYP450基因在拟南芥种子休眠调控中发挥重要作用。为探究该基因家族是否同样参与小麦种子休眠的调控，本研究首先分析了弱休眠小麦品种京411（J411）和强休眠小麦品种红芒春21（HMC21）种子吸胀6、9、12h（代表休眠解除过程）的转录组数据（图1A），共筛选出12个在两个品种间差异表达的CYP450基因（图1C），后续通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证了其表达模式，结果与转录组数据一致（图1D）。
为筛选参与种子休眠调控的关键CYP450基因，本研究进一步分析了这12个CYP450基因在J411、HMC21及145份重测序小麦品种中启动子区（起始密码子上游2.0kb）的序列变异，发现这些基因存在丰富的序列多态性。考虑到种子休眠在发育过程中建立、在后熟过程中逐渐解除，本研究通过RT-qPCR检测了12个CYP450基因在J411和HMC21种子不同发育阶段（开花后24、28、36天，代表休眠建立）和后熟阶段（收获后14、21、28天，代表休眠解除）的表达模式（图1B），仅TraesCS2A02G577800（命名为TaCYP94-A1）在休眠建立过程中稳定下调、在休眠解除过程中稳定上调（图1E、1F）。此外，且其在弱休眠品种J411中的表达量始终显著高于强休眠品种HMC21，提示该基因可能参与小麦种子休眠的调控。
为探究TaCYP94-A1与其他植物同源基因的进化关系，本研究从Ensembl数据库中选取13个植物CYP450同源蛋白构建系统发育树。结果显示，TaCYP94-A1与圆锥小麦TRITD2Av1G291530的序列一致性为100%，与水稻Os03g0223100和拟南芥AtCYP94的序列相似性分别为72.38%和49.13%。保守结构域数据库（CDD）分析表明，TaCYP94-A1及其同源蛋白（TRITD2Av1G291530、Os03g0223100、AtCYP94）均含有细胞色素P450 86家族的典型cd11064结构域，这是CYP86和CYP94亚家族的共同特征。这些结果表明，TaCYP94-A1在细胞色素P450家族中具有进化保守性和功能保守性。
图1. TaCYP94-A1的表达分析。（A）京411（J411）和红芒春21（HMC21）种子吸胀6、9、12h后的萌发表型。（B）京411和红芒春21种子在不同发育阶段（开花后24、28、36天，即休眠建立过程）的形态图。（C）基于京411和红芒春21种子吸胀6、9、12h的RNA-seq数据，分析TaCYP94-A1的表达水平（数据来源于Liu等人2023年的研究）。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验进行统计分析（***P<0.001），“ns”表示差异不显著。（D）通过RT-qPCR检测京411和红芒春21种子吸胀6、9、12h后TaCYP94-A1的相对表达量。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验进行统计分析（****P<0.0001）。（E）京411和红芒春21种子在开花后24、28、36天（DPA）时TaCYP94-A1的表达水平。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验进行统计分析（**P<0.01，****P<0.0001）。（F）京411和红芒春21种子在收获后14、21、28天（DAH，即休眠解除过程）时TaCYP94-A1的表达水平。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验进行统计分析（**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001）。以中国春小麦基因组为参考，从J411和HMC21中克隆得到TaCYP94-A1的启动子序列（2000bp）和编码序列（CDS，1577bp）。该基因含1个外显子，编码517个氨基酸，3′非翻译区（UTR）长度为23bp（图2A）。序列分析发现，J411和HMC21的TaCYP94-A1启动子区存在9个SNP位点，编码区存在1个同义突变；其中启动子区3个SNP位点（–1895bp，T/C；–1409bp，A/G；–1225bp，T/C）分别改变了分生组织表达调控元件（CAT-box）、赤霉素响应元件（TATC-box）和光响应元件（G-box）。
为验证上述启动子SNP位点是否影响TaCYP94-A1的转录活性，本研究在小麦原生质体中进行双荧光素酶（dual-LUC）报告基因实验。结果显示，分别从J411和HMC21中扩增的TaCYP94-A1启动子（TaCYP94-A1J411Pro和TaCYP94-A1HMC21Pro ）的荧光素酶活性均显著高于0800-empty-LUC空载体对照，且J411Pro的活性显著高于HMC21Pro（图2B,C）。为明确调控启动子活性差异的关键区域，本研究根据3个SNP位点的分布将TaCYP94-A1启动子分为3个片段：全长片段F1（–2000bp至–1bp）、截短片段F2（–1000bp至–1bp）和F3（–2000bp至–1001bp），实验发现两个启动子的3个片段活性均高于0800-empty-LUC空载体，且F3的活性显著强于F2，F3与F1的转录活性趋势一致（图2D,E），提示位于远端F3区域的3个SNP位点（C/T，–1895bp；G/A，–1409bp；C/T，–1,225bp）是导致两个启动子活性差异的关键。
为进一步验证该结果，本研究检测了2个强休眠品种（阆中白麦子、延边青稞麦，携带TaCYP94-A1HMC21Pro型等位基因：[C，–1895bp；G，–1409bp；C，–1225bp]）和2个弱休眠品种（淮麦1403、德麦100，携带TaCYP94-A1J411Pro型等位基因：[T，–1895bp；A，–1409bp；T，–1225bp]）的TaCYP94-A1启动子活性，发现强休眠品种的启动子活性显著低于弱休眠品种，与HMC21Pro和J411Pro之间观察到的活性差异一致（图2F）。进一步的定点突变实验表明，M1Pro（第-1895bp对处由T突变为C）和M2Pro（第-1,225碱基对处由T突变为C）突变显著降低了TaCYP94-A1J411Pro的启动子活性，而M3Pro突变（第-1,409碱基对处由A突变为G）则无显著影响。这些结果表明，位于第-1,895碱基对（C/T）和第-1,225碱基对（C/T）处的SNP是影响TaCYP94-A1启动子活性的关键变异位点（图2G、H）。
图2. TaCYP94-A1的序列变异与启动子活性分析。（A）弱休眠小麦品种京411（J411）和强休眠小麦品种红芒春21（HMC21）中TaCYP94-A1的序列分析。（B）用于检测两个TaCYP94-A1启动子变体（TaCYP94-A1J411Pro和TaCYP94-A1HMC21Pro）活性的报告载体结构示意图。萤火虫荧光素酶（LUC）作为报告基因，海肾荧光素酶（REN）作为内参基因。（C）小麦原生质体中TaCYP94-A1启动子变体的活性检测结果。以强启动子CaMV35s作为阳性对照，0800-empty-LUC启动子作为阴性对照。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验进行统计分析（**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001）。（D）TaCYP94-A1启动子截短片段的结构示意图。（E）转录激活实验结果表明，远端启动子片段（F3）中的SNP是导致（TaCYP94-A1J411Pro和TaCYP94-A1HMC21Pro）启动子活性差异的关键因素。数据以平均值±标准差表示（n=3），不同字母（a-f）表示经单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey检验后存在显著差异（P<0.05）。（F）两个强休眠小麦品种（阆中白麦子、延边青稞麦）与两个弱休眠小麦品种（淮麦1403、德麦100）在小麦原生质体中的启动子活性比较。阆中白麦子和延边青稞麦携带与TaCYP94-A1HMC21Pro一致的等位基因组合（C，-1895bp；G，-1409bp；C，-1225bp），淮麦1403和德麦100携带与TaCYP94-A1J411Pro对应的等位基因组合（T，-1895bp；A，-1409bp；T，-1225bp）。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验进行统计分析（**P<0.01，****P<0.0001）。（G）在TaCYP94-A1J411Pro启动子背景下进行定点突变的结构示意图。（H）小麦原生质体中，TaCYP94-A1J411Pro背景下三个SNP位点（T/C，-1895bp；A/G，-1409bp、T/C，-1225bp）定点突变后的转录活性变化。数据以平均值±标准差表示（n=3），不同字母（a-d）表示经单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey检验后存在显著差异（P<0.05）。
为探究3个SNP位点与种子休眠的DNA水平关联，本研究开发了3个酶切扩增多态性序列（CAPS）标记（TaCYP94-A11895、TaCYP94-A11409、TaCYP94-A11225），并利用这些标记对192份不同休眠性小麦品种（192WVs）、171份中国小麦微核心种质（171CMCCs）和174份J411×HMC21重组自交系（174JH-RILs）进行基因分型（图3A–3C），每个标记均检测到2种等位变异：TaCYP94-A11895T和TaCYP94-A11895C、TaCYP94-A11409A和TaCYP94-A11409G、TaCYP94-A11225T和TaCYP94-A11225C。曼-惠特尼U检验显示，TaCYP94-A11895和TaCYP94-A11225的两种等位变异在3个群体中的发芽指数（GI）和田间穗发芽率（FS）均存在显著差异，与TaCYP94-A11895T和TaCYP94-A11225T相比，TaCYP94-A11895C和TaCYP94-A11225C在所有群体中均与更低的GI和FS显著关联（图3D、E）；而TaCYP94-A11409的两种等位变异在GI和FS上无显著差异。
RT-qPCR分析显示，携带TaCYP94-A11895C（低GI/强休眠）的株系中TaCYP94-A1的表达量显著低于携带TaCYP94-A11895T（高GI/弱休眠）的株系；携带TaCYP94-A11225C（低GI/强休眠）的株系中TaCYP94-A1的表达量显著低于携带TaCYP94-A11225T（高GI/弱休眠）的株系；而TaCYP94-A1的表达量与携带TaCYP94-A11409不同等位变异的JH-RILs株系的GI无显著相关性，证实–1895bp（T/C）和–1225bp（T/C）通过调控TaCYP94-A1的转录影响种子休眠表型。
本研究进一步分析了TaCYP94-A11895和TaCYP94-A11225等位基因组合对种子休眠的联合效应，在192WVs和171CMCCs中鉴定出4种单倍型（Hap1-Hap4），其中Hap4的穗发芽抗性最强，Hap2和Hap3的穗发芽抗性中等（图3F-I）。单倍型频率分析显示，在115份地方品种中，3份（2.61%）携带Hap1、69份（60.00%）携带Hap2、5份（4.35%）携带Hap3、38份（33.04%）携带Hap4；而在195份改良品种中，105份（53.84%）携带Hap1、81份（41.54%）携带Hap2、7份（3.59%）携带Hap3、仅2份（1.03%）携带Hap4（图3J），提示小麦育种过程中Hap1受到正选择，而Hap2、Hap3和Hap4受到负选择。
图3. TaCYP94-A1启动子序列变异与种子休眠的关联性及等位基因频率分析。（A-C）基于小麦品种京411（J411）和红芒春21（HMC21）的TaCYP94-A1启动子区三个突变位点（T/C，-1895bp；A/G，-1409bp；T/C，-1225bp），开发了三个酶切扩增多态性序列（CAPS）标记（TaCYP94-A1¹⁸⁹⁵，TaCYP94-A1¹⁴⁰⁹，TaCYP94-A1¹²²⁵）。（D）在192份不同休眠性小麦品种（192WVs）、171份中国小麦微核心种质（171CMCCs）和174份京411×红芒春21重组自交系（174JH-RILs）中，TaCYP94-A11895（TaCYP94-A11895T和TaCYP94-A11895C）和TaCYP94-A11225（TACYP94-A11225T和TaCYP94-A11225C）的两种等位基因在萌发指数（GI）上存在显著差异。数据以平均值±标准差表示，采用Student's t检验进行统计分析（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。（E）在192WVs和171CMCCs中，TaCYP94-A1¹⁸⁹⁵（TaCYP94-A11895T和TaCYP94-A11895C）和TaCYP94-A1¹²²⁵（TaCYP94-A11225T和TaCYP94-A11225C）的两种等位基因在田间穗发芽率（FS）上存在显著差异。数据以平均值±标准差表示，采用Student's t检验进行统计分析（*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001）。（F-I）192WVs和171CMCCs中TaCYP94-A1的单倍型分析结果。数据以平均值±标准差表示，采用Student's t检验进行统计分析（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001），“ns”表示差异不显著。（J）115份地方品种和195份改良品种中，单倍型Hap1、Hap2、Hap3和Hap4的频率分布。
组学数据库比对显示，TaCYP94-A1（TraesFLD2A01G645500）与费尔德（Fielder）小麦中同源基因TraesFLD2B01G667200（44.91%）和TraesFLD2D01G009800（48.60%）的氨基酸序列一致性较低，且三者的细胞色素P450 86家族保守cd11064结构域存在显著差异，提示其可能存在功能分化。为验证TaCYP94-A1在小麦种子休眠中的功能，本研究利用CRISPR/Cas9技术在费尔德小麦中构建了3个TaCYP94-A1单基因敲除突变体（cyp94-a1#5、cyp94-a1#11、cyp94-a1#15）（图4A），突变特异性破坏了TaCYP94-A1的蛋白功能，未影响其同源基因TaCYP94-B和TaCYP94-D的序列与功能。田间生理成熟收获的种子经5d水培吸胀处理后，cyp94-a1#5（76%）、cyp94-a1#11（78%）、cyp94-a1#15（82%）的发芽率（GP）显著低于野生型费尔德小麦（99%）（图4B，C）；且3个敲除突变体完整穗中可见发芽粒率（PVSK，37%）显著低于费尔德小麦（72%）（图4D，E）。
本研究同时在费尔德小麦中构建了3个携带TaCYP94-A1的过表达株系（TaCYP94-A1-OE#3、TaCYP94-A1-OE#9、TaCYP94-A1-OE#12）（图4F）。人工气候箱种植的小麦在生理成熟后收获穗和种子，经3d水培吸胀处理后，3个过表达株系的发芽率（93%）和可见发芽粒率（72%）均显著高于费尔德小麦（发芽率70%、可见发芽粒率19%）（图4G–J）。上述结果证实，TaCYP94-A1负调控小麦种子休眠和穗发芽抗性。
为探究TaCYP94-A1的育种应用潜力，本研究检测了TaCYP94-A1敲除突变体种子在田间条件下的出苗率和发芽整齐度。生理成熟种子室温贮藏5周解除休眠后进行发芽率检测，敲除突变体与费尔德小麦的种子均在2d内达到近100%的发芽率（图4K）；田间试验表明，TaCYP94-A1敲除突变体在株高、穗长、有效分蘖数、粒长、粒宽、千粒重等关键农艺性状上与费尔德小麦无显著差异，提示TaCYP94-A1是通过基因编辑培育穗发芽抗性小麦品种的优良靶标基因。
图4. TaCYP94-A1负调控小麦种子休眠。（A）通过CRISPR/Cas9技术获得的TaCYP94-A1序列突变。cyp94-a1#5和cyp94-a1#15均存在单个鸟嘌呤插入，导致移码突变，产生169个氨基酸的截短蛋白；cyp94-a1#11存在2个碱基缺失，导致移码突变，产生168个氨基酸的截短蛋白。图中红色方框表示细胞色素P450家族86的保守cd11064结构域。（B）cyp94-a1#5/11/15突变体与野生型费尔德（Fielder）种子在恒温培养箱（23℃±2℃）中吸胀5天后的萌发表型。（C）cyp94-a1#5/11/15突变体与费尔德种子的萌发率（GP）统计。实验设置3个生物学重复，每个重复对每个材料各检测30粒种子。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验进行统计分析（***P<0.001）。（D）cyp94-a1#5/11/15突变体与费尔德穗及种子在人工气候箱（23℃±2℃）中吸胀5天后的萌发表型。（E）cyp94-a1#5/11/15突变体与费尔德穗吸胀5天后的可见发芽籽粒率（PVSK）统计。实验重复3次，每个重复对每个材料至少检测5个穗。数据以平均值±标准差表示（n=5），采用Student's t检验进行统计分析（**P<0.01）。（F）TaCYP94-A1过表达株系（TaCYP94-A1-OE#3/9/12）与费尔德中TaCYP94-A1的表达量分析。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验进行统计分析（****P<0.0001）。（G）TaCYP94-A1-OE#3/9/12株系与费尔德种子在恒温培养箱（23℃±2℃）中吸胀3天后的萌发表型。（H）TaCYP94-A1-OE#3/9/12株系与费尔德种子的萌发率统计。实验设置3个生物学重复，每个重复检测30粒种子。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验进行统计分析（***P<0.001）。（I）TaCYP94-A1-OE#3/9/12株系与费尔德穗及种子在人工气候箱（23℃±2℃）中吸胀3天后的萌发表型。（J）TaCYP94-A1-OE#3/9/12株系与费尔德穗吸胀3天后的可见发芽籽粒率统计。实验重复3次，每个重复至少检测5个穗。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验进行统计分析（**P<0.01，***P<0.001）。（K）田间收获的cyp94-a1#5/11/15突变体与费尔德种子经室温贮藏5周后的萌发率。数据以平均值±标准差表示（n=3），“ns”表示差异不显著。
TaCYP94-A1在拟南芥和水稻中负调控种子休眠
同源基因在不同植物物种中常表现出进化上的功能保守性。为探究TaCYP94-A1是否调控拟南芥种子休眠，本研究获得了3个拟南芥Col-0背景的TaCYP94-A1过表达株系（35S:TaCYP94-A1-2/5/6）和1个T-DNA插入突变体atcyp94d1。结果显示，atcyp94d1突变体的发芽率（57%）显著低于Col-0（88%），而3个TaCYP94-A1过表达株系的发芽率（95%-97%）显著高于Col-0（82%）；在atcyp94d1背景下构建的互补株系（35S:TaCYP94-A1/atcyp94d1）发芽特性与Col-0相似，且发芽率显著高于atcyp94d1，说明TaCYP94-A1与AtCYP94D1功能保守，均参与种子休眠的负调控。
本研究进一步探究了TaCYP94-A1在水稻中的功能保守性，将TaCYP94-A1的CDS转化日本晴水稻（Nip），获得3个过表达株系（35S:TaCYP94-A1-1/2/3）；同时利用CRISPR/Cas9技术在中花11（ZH11）背景下敲除水稻同源基因OsCYP94，获得oscyp94突变体。结果显示，3个TaCYP94-A1过表达株系的发芽率（98%-100%）显著高于日本晴（81%），新鲜收获的成熟穗种子休眠性弱于日本晴；而oscyp94突变体的发芽率显著降低，新鲜收获的成熟穗种子发芽延迟。互补株系35S:TaCYP94-A1/oscyp94的发芽率（86%）与中花11（84%）相近，且显著高于oscyp94（66%），其成熟穗种子发芽特性与中花11相似，且较oscyp94提前。上述结果表明，TaCYP94-A1与OsCYP94功能保守，均在水稻中负调控种子休眠和穗发芽抗性。
TaABI4和TaNAC-A1直接结合TaCYP94-A1启动子
鉴于TaCYP94-A1在强、弱休眠种子中的表达量存在显著差异，本研究利用植物启动子分析导航系统预测两个关键SNP位点（–1895bp，T/C；–1225bp，T/C）是否通过改变启动子中的转录因子结合位点（TFBS）调控种子休眠，发现这两个SNP位点分别改变了AP2/ERF和NAC家族转录因子的结合位点；与弱休眠品种J411的启动子相比，强休眠品种HMC21启动子中–1895bp和–1225bp的T→C突变分别引入了AP2/ERF和NAC的结合位点。
整合J411和HMC21种子吸胀6-12h的RNA-seq数据与中国春小麦组织表达数据库数据发现，AP2/ERF家族基因TaABI4（ABA‐insensitive 4，TraesCS1A02G223400）和NAC家族基因TaNAC-A1（TraesCS1A02G263700）在J411和HMC21种子中的表达量差异显著，TaABI4在HMC21种子中的表达量显著更高，而TaNAC-A1则相反；且两个基因在种子中的表达量显著高于根、茎、叶和穗。作为脱落酸信号增强子，ABI4在种子休眠和穗发芽抗性调控中发挥重要作用，RT-qPCR分析进一步证实TaABI4和TaNAC-A1的表达量与种子休眠表型显著相关，说明二者可能调控TaCYP94-A1的表达。
为验证该调控关系，本研究通过染色质免疫沉淀qPCR（ChIP-qPCR）检测TaABI4和TaNAC-A1在TaCYP94-A1启动子区的富集情况，结果显示，与阴性对照相比，TaNAC-A1-FLAG的免疫沉淀产物中TaCYP94-A1启动子的N1和N3区域显著富集，TaABI4-FLAG的免疫沉淀产物中A2和A4区域显著富集（图5A-C），证实TaNAC-A1和TaABI4可在体内直接结合TaCYP94-A1启动子。酵母单杂交（Y1H）和电泳迁移率变动分析（EMSA）进一步证实，TaNAC-A1可特异性结合HMC21Pro启动子中的5′-GACTTC-3′（C，–1225bp）和5′-GAACGC-3′（–233bp）基序，以及J411Pro启动子中的5′-GAACGC-3′（–233bp）基序（图5D–5F）；而TaABI4可特异性结合HMC21Pro启动子中的5′-ACCGC-3′（C，–1895bp）和5′-CCGGC-3′（–565bp）基序，以及J411Pro启动子中的5′-CCGGC-3′（–565bp）基序（图5D-H）。双荧光素酶报告基因实验显示，TaNAC-A1可激活J411Pro和HMC21Pro的转录活性，且对HMC21Pro的激活作用更强（图5I，J）；而TaABI4可显著抑制两个启动子的活性，且对HMC21Pro的抑制作用更显著（图5，K）。鉴于TaCYP94-A1J411Pro和TaCYP94-A1HMC21Pro的近端F2和远端F3区域均含有TaNAC-A1和TaABI4的结合位点，后续双荧光素酶实验证实，两个转录因子均可调控F2和F3片段的启动子活性。
图5. TaABI4和TaNAC-A1直接结合TaCYP94-A1的启动子。（A）TaCYP94-A1启动子的结构示意图。绿色三角形表示预测的NAC转录因子结合基序；橙色三角形表示预测的AP2/ERF转录因子结合基序。标尺=200bp。（B、C）ChIP-qPCR分析结果显示，TaNAC-A1结合TaCYP94-A1启动子的N1和N3区域，TaABI4结合A2和A4区域。ChIP实验使用抗FLAG抗体和抗IgG抗体进行，相对富集倍数以阴性对照为基准（值=1）计算。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验进行统计分析（**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001），“ns”表示差异不显著。（D）Y1H实验表明，TaNAC-A1和TaABI4均可结合TaCYP94-A1的两种启动子变体（TaCYP94-A1J411Pro和TaCYP94-A1HMC21Pro）。转化后的酵母细胞以10⁻¹稀释度接种到选择性培养基上。（E、F）EMSA结果显示，TaNAC-A1可高亲和力结合TaCYP94-A1HMC21Pro启动子中的GACTTC和GAACGC基序，以及TaCYP94-A1J411Pro和启动子中的GAACGC基序。“+”和“–”分别表示存在或不存在探针或蛋白。实验重复两次，结果一致。（G、H）EMSA结果显示，TaABI4可高亲和力结合TaCYP94-A1HMC21Pro启动子中的ACCGC和CCGGC基序，以及TaCYP94-A1J411Pro启动子中的CCGGC基序。“+”和“–”分别表示存在或不存在探针或蛋白。实验重复两次，结果一致。（I）双荧光素酶（dual-LUC）瞬时表达实验所用各载体的结构示意图。（J）dual-LUC瞬时表达实验显示，TaNAC-A1可激活由TaCYP94-A1J411Pro和TaCYP94-A1HMC21Pro启动子驱动的荧光素酶（LUC）报告基因表达，且对TaCYP94-A1HMC21Pro启动子的激活作用显著更强。数据以平均值±标准差表示（n=3），不同字母（a-e）表示经单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey检验后存在显著差异（P<0.05）。（K）dual-LUC瞬时表达实验显示，TaABI4可抑制由TaCYP94-A1HMC21Pro和TaCYP94-A1J411Pro启动子驱动的LUC报告基因表达，且对TaCYP94-A1HMC21Pro启动子的抑制作用显著更强。数据以平均值±标准差表示（n=3），不同字母（a-e）表示经单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey检验后存在显著差异（P<0.05）。
TaABI4与TaNAC-A1互作调控小麦种子休眠
鉴于TaABI4和TaNAC-A1均可直接结合TaCYP94-A1启动子，本研究推测二者可能存在蛋白互作，酵母双杂交（Y2H）、Pull-down、免疫共沉淀（Co-IP）和双分子荧光互补（BiFC）实验证实，TaABI4与TaNAC-A1存在细胞核内蛋白-蛋白相互作用。为鉴定二者的具体互作结构域，将TaNAC-A1分为N端、中央NAC结构域和C端，酵母双杂交分析显示，仅NAC结构域可与TaABI4互作；对TaABI4进行截短分析发现，其LRP结构域介导了与TaNAC-A1的互作。
双荧光素酶报告基因实验表明，TaNAC-A1单独表达可显著增强荧光素酶活性，TaABI4单独表达则起抑制作用；而二者共表达时荧光素酶活性处于中间水平，且对J411Pro的激活作用显著强于HMC21Pro，证实TaABI4可部分抑制TaNAC-A1对HMC21Pro的激活作用，且二者存在拮抗互作。结合二者对TaCYP94-A1表达的拮抗调控作用，本研究检测了3个基因在HMC21休眠和非休眠种子中的表达模式，发现休眠种子（36DPA）中TaABI4的表达量显著高于TaCYP94-A1和TaNAC-A1；而室温贮藏5周的非休眠种子中，TaCYP94-A1和TaNAC-A1的表达量显著上调并超过TaABI4，说明TaABI4与TaNAC-A1的拮抗调控可精细调节种子休眠水平。
为验证TaABI4和TaNAC-A1在小麦种子休眠中的功能，本研究首先获得了J411背景下的EMS诱变突变体tanac-a1-j411，该突变体在TaNAC-A1保守NAC结构域的28位氨基酸处存在C/T突变，导致不带电荷的极性氨基酸苏氨酸（Thr）突变为非极性氨基酸甲硫氨酸（Met）（图6A）。结果显示，tanac-a1-j411的发芽率（62%）显著低于J411（92%），且未发芽种子经4℃低温处理后可萌发，表明其种子休眠性增强（图6B，C）。本研究同时利用CRISPR/Cas9技术在费尔德小麦中构建了3个TaABI4敲除突变体（abi4#3、abi4#8、abi4#12）（图6F），其发芽率（abi4#3为80%、abi4#8为82%、abi4#12为76%）均显著高于费尔德小麦（58%）（图6G、H）。
此外，本研究在费尔德小麦中构建了TaNAC-A1过表达株系（TaNAC-A1-OE#9、TaNAC-A1-OE#14、TaNAC-A1-OE#19）和TaABI4过表达株系（TaABI4-OE#5、TaABI4-OE#7、TaABI4-OE#8），TaNAC-A1过表达株系的发芽率（92%）显著高于费尔德小麦（75%）（图6D，E），而TaABI4过表达株系则呈现相反趋势（图6I，J），且其未发芽种子经4℃低温处理后可完全萌发。RT-qPCR分析显示，TaNAC-A1过表达种子中TaCYP94-A1的表达量显著高于费尔德小麦，而TaABI4过表达种子中则显著降低，证实二者对TaCYP94-A1的转录存在负调控作用。
为进一步验证该调控关系，本研究构建了TaABI4-OE#8/TaCYP94-A1-OE#3双过表达株系和TaNAC-A1-OE#14/cyp94-a1#5过表达/敲除双突变株系。结果显示，TaCYP94-A1过表达可部分恢复TaABI4过表达导致的发芽率降低表型（从42%恢复至71%）（图6K-N）；而TaCYP94-A1敲除可部分抑制TaNAC-A1过表达导致的发芽率升高表型（图6O-Q）。上述结果证实，TaABI4与TaNAC-A1通过拮抗调控TaCYP94-A1的转录，协同控制小麦种子休眠。
图6.小麦种子休眠中TaABI4和TaNAC-A1的功能及其与TaCYP94-A1的调控关系。（A）TaNAC-A1的EMS突变体tanac-a1-j411的序列变异情况。（B）tanac-a1-j411突变体和野生型京411（J411）种子吸胀3天后的表型；未萌发的种子经4℃处理3天，再置于培养箱中培养2天。（C）tanac-a1-j411和京411种子吸胀3天后的发芽率。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验分析显著性（***P<0.001）。（D）TaNAC-A1过表达株系（TaNAC-A1-OE#9/14/19）和费尔德种子吸胀3天后的表型。（E）TaNAC-A1过表达株系（TaNAC-A1-OE#9/14/19）和费尔德种子的发芽率。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验分析显著性（**P<0.01）。（F）TaABI4三突变体abi4#3/8/12中，基因TraesCS1A02G223400及其同源基因TraesCS1B02G236700、TraesCS1D02G225000的突变位点。（G）abi4#3/8/12突变体和费尔德种子吸胀3天后的表型。（H）abi4#3/8/12突变体和费尔德种子的发芽率。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验分析显著性（**P<0.01）。（I）TaABI4过表达株系（TaABI4-OE#5/7/8）和费尔德种子吸胀5天后的表型。（J）TaABI4过表达株系（TaABI4-OE#5/7/8）和费尔德种子的发芽率。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验分析显著性（**P<0.01，***P<0.0001）。（K）费尔德、TaABI4-OE#8以及TaABI4-OE#8/TaCYP94-A1-OE#3双过表达株系种子吸胀3天后的表型。（L、M）TaABI4-OE#8/TaCYP94-A1-OE#3双过表达株系中TaABI4和TaCYP94-A1的表达分析。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验分析显著性（****P<0.0001）。（N）费尔德、TaABI4-OE#8以及TaABI4-OE#8/TaCYP94-A1-OE#3双过表达株系种子的发芽率。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验分析显著性（****P<0.0001）；ns表示无显著差异。（O）费尔德、TaNAC-A1-OE#14以及TaNAC-A1-OE#14/cyp94-a1#5株系种子吸胀3天后的表型。（P）TaNAC-A1-OE#14/cyp94-a1#5株系中TaNAC-A1的表达分析。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验分析显著性（****P<0.0001）。（Q）费尔德、TaNAC-A1-OE#14以及TaNAC-A1-OE#14/cyp94-a1#5株系种子的发芽率。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验分析显著性（***P<0.001）；ns表示无显著差异。
TaABI4/TaNAC-A1–TaCYP94-A1模块通过ABA、GA和JA通路介导种子休眠
脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）是调控种子休眠的核心植物激素，ABA诱导并维持种子休眠，GA解除休眠并促进萌发；茉莉酸（JA）则通过协同ABA的功能增强种子休眠。CYP94家族成员可通过催化茉莉酰异亮氨酸（JA-Ile）的连续氧化参与该过程。为探究TaABI4/TaNAC-A1–TaCYP94-A1模块是否通过与上述激素的交叉互作调控小麦种子休眠，本研究检测了TaABI4过表达株系、TaNAC-A1过表达株系、TaCYP94-A1敲除突变体及费尔德小麦种子在吸胀0、24、48h时ABA、GA和JA-Ile的含量。吸胀24h后，TaNAC-A1-OE#14的种子全部萌发，而费尔德小麦种子均未萌发；吸胀48h后，费尔德小麦种子全部萌发，而TaABI4-OE#8和cyp94-a1#5/11/15的种子均未萌发。与费尔德小麦相比，TaABI4-OE#8和cyp94-a1#5/11/15种子的GA含量和CYP450酶活性显著降低，而ABA和JA-Ile含量显著升高（图7A,B）；TaNAC-A1-OE#14种子则呈现相反的变化趋势（图7C），提示该调控模块通过调节上述激素的含量调控种子休眠。
本研究进一步分析了J411和HMC21种子吸胀6-12h的RNA-seq数据，筛选出ABA、GA和JA通路中的差异表达基因（DEG），并通过RT-qPCR验证了其表达模式。结果显示，TaABI4过表达株系和cyp94-a1#5/11/15突变体中，GA生物合成相关基因（TaGA20ox1、TaGA3ox2）、ABA代谢相关基因（TaABA8′OH2）及GA信号通路基因（TaGASR7）的表达量显著下调，而ABA信号通路基因（TaABI5）和JA信号通路基因（TaCOI1、TaMYC2）的表达量显著上调；相反，TaNAC-A1过表达株系中TaGA20ox1、TaGA3ox2和TaABA8′OH2显著上调，而TaABI5和TaCOI1显著下调。
值得注意的是，微管调控因子（如MAP65）参与GA诱导的种子休眠解除，本研究在J411和HMC21种子吸胀6-12h的样本中鉴定出4个差异表达的微管组织调控基因，RT-qPCR验证了其表达模式，其中TaMAP65-1的表达量最高，选为后续研究对象。结果显示，TaMAP65-1在TaABI4过表达株系和cyp94-a1#5/11/15突变体中显著下调，而在TaNAC-A1过表达株系中显著上调，支持其在种子休眠解除中的作用。
为进一步分析TaCYP94-A1敲除对GA代谢的影响，本研究检测了cyp94-a1#5和费尔德小麦种子吸胀0h、48h时的GA含量，发现与野生型相比，cyp94-a1#5种子中活性GA1和GA3的含量显著降低，而活性GA4和GA7的含量无显著变化（图7D），提示TaCYP94-A1通过影响活性GA1和GA3的含量调控小麦种子休眠。综上，TaABI4/TaNAC-A1–TaCYP94-A1模块通过调控GA、ABA和JA通路介导小麦种子休眠的调控。
图7.转基因小麦和野生型费尔德（Fielder）种子中的植物激素含量与细胞色素P450酶活性。（A）TaCYP94-A1基因CRISPR/Cas9编辑株系与费尔德种子的脱落酸（ABA）、赤霉素（GA，活性赤霉素）、茉莉酸-异亮氨酸结合物（JA-Ile）含量及细胞色素P450酶活性。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验分析显著性（***P<0.001，****P<0.0001）。（B）TaABI4过表达株系与费尔德种子的脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、茉莉酸-异亮氨酸结合物（JA-Ile）含量及细胞色素P450酶活性。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验分析显著性（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001）。（C）TaNAC-A1过表达株系与费尔德种子的脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、茉莉酸-异亮氨酸结合物（JA-Ile）含量及细胞色素P450酶活性。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验分析显著性（***P<0.001，****P<0.0001）。（D）赤霉素（GA）生物合成途径示意图，及cyp94-a1#5突变体与费尔德种子吸胀0h和48h后指定GA代谢物的含量。FW=鲜重；n.d.=未检测到；n.t.=未检测。蓝色箭头代表非13-羟化途径（GA15、GA24、GA9、GA4、GA7）；红色箭头代表早期13-羟化途径（GA44、GA19、GA20、GA5、GA1和
GA3）。数据以平均值±标准差表示（n=3），采用Student's t检验分析显著性（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001）。