拟南芥外植体可在富含细胞分裂素的芽分化培养基（SIM）上形成芽。然而，番茄下胚轴在受到创伤胁迫时，既可以再生出芽，也可以再生出根。因此，我们建立了一套番茄再生体系，用于研究切割出芽（不经过愈伤诱导培养基CIM和芽分化培养基SIM的预培养）背后的生理变化与分子机制（图1A）。创伤处理14天后，切口处可形成具有发育完整的芽和叶片的完整植株（图1A）。
利用体视显微镜对愈伤组织形成和芽起始过程进行详细观察（图1B），结果显示，创伤后2天，下胚轴中部开始形成愈伤组织；创伤后4天，形成具有多能性的愈伤组织；创伤后第10天，在切口处可观察到从头形成的芽（图1B）；第12天可观察到叶原基和幼叶（图1C）。为更精准地观察愈伤组织和芽形成过程中的起始细胞，制备了石蜡切片，以阐明创伤诱导的细胞分化与器官再生过程中的细胞形态动态变化。这些观察结果表明，将发育形成新芽的多能性愈伤组织可能起源于中柱鞘细胞（图1C）。切口处愈伤组织的纵切结果显示，中柱鞘细胞分裂形成胚性愈伤组织，进而在14天内再生出芽和叶片（图1C）。形态特征的变化表明，番茄从头芽器官发生的起始细胞为中柱鞘细胞。从头芽再生过程可划分为多个不同阶段，包括愈伤诱导期（0小时～第2天）、愈伤形成期（第2～4天）、切割诱导愈伤组织内的细胞命运定型期（第4～8天）、茎尖分生组织（SAM）形态建成期（第8～10天）以及芽生长发育期（第10～12天）（图1）。
图1.番茄芽再生过程的时序分析。（A）切口处的切割出芽现象。与第0天（0D）的初始外植体相比，创伤处理14天（D）后可获得带有叶片和芽的完整植株；比例尺：1厘米。（B）创伤后0、2、4、8、10、12天（D）愈伤组织与芽形成的时序对比分析；比例尺：1毫米。（C）切割诱导的细胞分化与器官再生的形态特征。创伤后0、4、8、12天的石蜡切片；比例尺：2毫米。为阐明中柱鞘细胞形成愈伤组织和茎尖分生组织的分化过程，我们选取创伤后第4、8、12天的愈伤组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析（图1B、C）。基于统一流形逼近与投影（UMAP）算法，将第4、8、12天的愈伤组织细胞划分为16个细胞簇（簇0至15）并可视化。比较不同分化阶段各细胞簇的比例发现，簇1、2、10的细胞比例随分化进程逐渐升高，而簇3、7的细胞比例逐渐降低（图2A），表明簇2和簇10的细胞类型可能是细胞分化过程中新产生的。对0至15号细胞簇的细胞类型注释结果显示，切割诱导产生的愈伤组织、芽和叶片主要包含六大类细胞：表皮细胞（簇6）、皮层细胞（包括外皮层和内皮层，簇3和5）、中柱鞘细胞（簇0、12、14）、分生组织细胞（簇1、4、7）、类静止中心细胞（簇15）以及芽细胞（簇2、10、11）。在簇6的表皮细胞中，多个表皮标记基因高表达，包括BODYGUARD1（BDG1）、原表皮因子1（PDF1）、PDF2、3-酮脂酰辅酶A合成酶（KCS）和ROC3。皮层关键基因如外皮层标记基因（MYB和WRKY）特异地在簇5细胞中表达；内皮层标记基因SCARECROW9（SCR9）、SCR11和KCS11特异地在簇3和5细胞中表达。韧皮部、原韧皮部和木质部细胞标记基因IP5P7、IPN2、SLK2和SEU在中柱鞘细胞（簇0、12、14）中表达。在簇1、4、7的分生组织细胞中表达的基因包括WUS以及一些关键的分生组织发育相关基因（SlGRF1和ESR）。在簇15中，仅少数细胞检测到类静止中心细胞标记基因WOX5和SlCYCD6-1的表达，但多个关键的从头芽起始相关基因（PIN1A、PIN1C和ATHB15）特异地在簇15细胞中表达，表明这类细胞可能处于从分生组织前体细胞向分生组织细胞过渡的状态。在簇10、15、17的分生组织细胞中，与茎尖细胞相关的基因甘氨酸脱氢酶1（GLDC1）呈现高表达水平。通过重构拟时间轨迹，我们确定中柱鞘细胞可分化为茎尖细胞和皮层细胞（图2B、C）。
在拟南芥中，WUS是调控茎尖分生组织（SAM）建成的核心基因。本研究的单细胞测序数据显示，SlGRF1、AINTEGUMENTA（ANT）和茎尖分生组织无分生组织活性（STM）特异地在分生组织细胞中表达，并与WUS共表达（图2D）。UMAP图谱证实ANT、STM和SlGRF1均在分生组织细胞中表达（图2C、D）。此外，WUS和STM的活性对于新芽分生组织的启动至关重要。我们对这三个基因在细胞分化过程中的表达变化进行了拟时间分析，转录本积累的UMAP图谱表明，SlGRF1可能与再生过程中向出芽方向的细胞分化轨迹相关（图2E）。
图2.愈伤组织形成与芽起始的单细胞RNA测序分析。（A）UMAP图展示创伤后4～12天愈伤组织中16个细胞簇的动态变化。16个不同细胞群体用颜色区分。簇1、4、7的细胞群体用绿色圆圈标出。（B）切割诱导愈伤组织形成的拟时间轨迹分析。（C）图示各细胞簇内的细胞分布及其拟时间轨迹。箭头指示两条细胞分化路径。拟时间轨迹分析用于重构芽起始和中柱鞘细胞分化的发育动态，每个点代表一个单细胞。（D）UMAP图展示在类分生组织细胞群中表达量显著上调的代表性转录因子基因的表达模式。绿色圆圈内的细胞群体为类分生组织细胞。（E）基于UMAP可视化代表性基因在拟时间进程中的表达动力学。不同颜色点代表不同细胞类型。对前10个分支依赖性差异表达基因的拟时间分析鉴定出两条不同的分化轨迹，分支1指向类分生组织细胞，分支2指向类芽细胞。
为验证单细胞测序数据并进一步研究愈伤组织形成过程，本研究完成了芽再生期间（0～12天）的时间序列转录组分析。火山图展示了创伤后4天与0小时相比筛选出的4112个上调基因（红点）和2976个下调基因（绿点）（图3A）。荧光定量PCR（RT‑qPCR）结果与转录组测序数据一致，显示SlGRF1、WUS、STM和ANT的表达水平在芽形成过程中显著上调（图3B）。
为验证上述结果，采用酪胺信号放大（TSA）原位杂交（ISH）技术追踪SlGRF1在愈伤组织切片中的分布。结果显示，标记的SlGRF1荧光信号在类分生组织区域以及切割诱导愈伤组织细胞的细胞核中均能被检测到（图3C）。这些结果与单细胞测序数据共同表明，创伤特异性诱导的SlGRF1表达可能与切口处的出芽过程相关。为从功能上鉴定其他SlGRF基因在切割出芽中的潜在作用，本研究鉴定并分析了13个番茄SlGRF基因（图3D）。表达热图显示，在所有GRF家族成员中，只有SlGRF1在切割出芽早期（2～4天）呈现明显的上调趋势（图3E）。为探究SlGRF1在芽再生中的功能，利用CRISPR/Cas9系统获得了两个SlGRF1敲除突变体株系（grf1‑cr1和grf1‑cr2）。本研究比较了grf1‑cr1、grf1‑cr2与野生型对照的切割出芽能力。结果显示，grf1‑cr1和grf1‑cr2在创伤后均无法正常形成芽（图3F）。与野生型对照相比，grf1‑cr1和grf1‑cr2的愈伤组织形成能力更强，但芽形成能力受到显著抑制（图3F）。创伤后12天，野生型对照的切口处可观察到发育良好的芽，而grf1‑cr1和grf1‑cr2的切口处仅形成愈伤组织。创伤后16天，野生型对照已长出发育完全的叶片，而grf1‑cr1和grf1‑cr2仅产生少量芽（图3F、G）。
图3.SlGRF1调控切割出芽过程中的芽起始。（A）创伤后4天愈伤组织中差异表达基因的火山图（与0小时表达水平相比）。时间序列转录组分析显示，代表性转录因子基因SlGRF1、ANT和STM均属于上调基因。（B）时间序列RNA测序数据显示，SlGRF1、ANT和STM在切割出芽起始阶段被激活的类分生组织细胞中高表达。数据来自3次独立实验，以平均值±标准差表示（n=45）。星号表示经单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验具有显著差异（***P<0.001）。（C）对创伤后12天样品的切口部位石蜡切片进行TSA‑ISH实验，检测SlGRF1的表达。（D）番茄SlGRF家族的系统发育树；At代表拟南芥，Sl代表番茄。（E）切割出芽过程中SlGRF家族基因表达谱热图。（F）grf1‑cr1、grf1‑cr2及AC（野生型）样品切口处的愈伤组织形成与芽再生情况。（G）创伤后12天和16天，AC（野生型）与SlGRF1突变体番茄植株切口处的芽再生比例（n=42–50）。
为鉴定创伤响应过程中发生改变的生物学通路，我们对切割后0小时与4天下胚轴切口处的差异表达基因（DEGs）进行了KEGG富集分析。该分析显示“植物激素信号转导”为显著富集的通路（图4A）。为阐明切割出芽过程中激素的动态变化及相关效应，我们采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统，对创伤后0小时、4小时、1天、2天、4天、8天、10天和12天采集的外植体切口处内源植物激素进行了分析（图4B）。在愈伤组织形成初期（创伤后0小时至2天的下胚轴外植体），只有细胞分裂素核苷-反式玉米素核苷（tZR）的浓度大幅上升。相比之下，吲哚-3-乙酸（IAA）、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）的浓度均出现不同程度下降（图4B）。在愈伤组织生长阶段（创伤后2–4天的下胚轴外植体），GA1和JA显著积累。尽管JA浓度在第4天后持续上升并在第10天达到峰值，但GA1浓度在第4天后显著下降，直至回落至第2天之前的水平。在创伤后4天的下胚轴外植体中，IAA、SA和ABA的浓度出现不同程度的上升（图4B）。由此，我们揭示了不施加外源激素条件下芽再生过程中的激素变化规律。为明确激素对芽再生的影响，我们在创伤后1天将tZR、GA1、IAA和JA施加于下胚轴切口处，随后监测芽再生情况。外源IAA、tZR和JA均未显著改变芽再生过程，而GA1处理特异性地抑制了这一过程，在促进愈伤组织生长和下胚轴伸长的同时减少了芽的数量（图4C、D）。相反，赤霉素生物合成抑制剂多效唑（Pac）能够恢复并增强再生能力，使每株植株的从头出芽数增加至约20个（图4C、D）。这些结果表明，GA1作为负调控因子参与切割诱导的芽起始与发育过程。
图4.创伤影响多种植物激素及其在切割出芽不同阶段的功能。（A）第4天与0小时相比差异表达基因的KEGG通路富集分析。（B）切割出芽过程中切口处内源激素的动态变化。在创伤后0小时、4小时以及1、2、4、8、10、12天分别测定激素含量。数据来自3次独立实验，以平均值±标准差表示（n=45）。（C）切口处不同外源激素处理对切割出芽的影响。（D）创伤后12天，GA1、多效唑（Pac）和清水处理后芽再生情况的统计分析。数据来自一次独立实验，以平均值±标准差表示（n=12）。星号表示与对照组相比经Student’s t检验具有极显著差异（P<0.001）。
SlGRF1在赤霉素信号通路下游发挥作用并介导切割出芽起始
在GA1、多效唑（Pac）和清水（对照）处理后第10天（创伤后第11天），通过体视显微镜观察愈伤组织形成和芽起始情况。GA1处理未能诱导可见的芽形成，而Pac处理则显著促进愈伤组织表面大量可见芽的出现（图5A）。创伤后第17天，GA1处理样品的切口处未观察到明显的芽再生，而Pac处理样品与对照组相比，芽和叶片的形成能力显著增强（图5B）。从形态特征与表型来看，GA1处理样品与grf1‑cr1、grf1‑cr2突变体在创伤后的愈伤组织形成状态和芽起始缺陷方面表现相似（图3E、4C和5B）。已有研究表明，赤霉素在水稻中通过降解DELLA蛋白增强GRF4转录活性，进而共同调控光合作用和氮吸收。受此启发，我们通过RNA测序研究GRF1在赤霉素信号传导中的作用。对GA1、Pac或清水处理后第1、3、7天的切口样品进行转录组分析。结果显示，多个赤霉素诱导的标记基因（包括GASA基因家族）在GA1处理后显著上调，而在Pac处理后下调（相对于相应对照组水平）。赤霉素受体基因GID1a的表达在GA1处理后显著降低，而在Pac处理后升高（相对于对照组水平）（图5C）。值得注意的是，转录组分析显示，外源施加GA1后，切口处SlGRF1的表达显著下调，同时WUS的表达上调。为阐明赤霉素信号与SlGRF1表达之间的调控机制，我们构建了della‑cr突变体，该突变体缺失功能型DELLA蛋白（赤霉素信号通路的关键抑制因子）。创伤诱导表达分析显示，与野生型对照相比，della‑cr突变体的GID1a和SlGRF1表达显著下调，而WUS表达显著上调（图5D）。della‑cr突变体中的这些转录变化与外源GA1处理后的表达模式高度一致。对10天龄幼苗的比较发现，della‑cr突变体的下胚轴长度是野生型的2倍，这与外源GA1处理后的典型生长变化一致（图4C、5E）。综上所述，赤霉素可能通过抑制SlGRF1而非WUS的表达来负调控切割诱导的芽起始。
图5.赤霉素A1通过SlGRF1抑制芽起始。（A、B）GA1、多效唑（Pac）和清水（对照）处理后切口处芽形成的代表性图像。分别为创伤后11天（A）和17天（B）的体视显微镜照片。（C）切割出芽过程中，经GA1和Pac处理1、3、7天后，GID1a、SlGRF1、WUS、ANT和STM表达量的RT‑qPCR检测结果。数据为平均值±标准差（n=3个生物学重复）。（D）创伤条件下，della‑cr突变体与AC（野生型）植株中GID1a、SlGRF1和WUS表达量的RNA‑seq数据。数据来自3次独立实验，以平均值±标准差表示（n=45）。（B、C）不同字母表示经单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验差异显著（P<0.05）。（E）AC（野生型）、grf1‑cr1及della‑cr突变体的下胚轴长度。幼苗在25℃、长日照条件（16小时光照/8小时黑暗）下培养8天。数据来自一次独立实验，以平均值±标准差表示（n=12株独立幼苗）。星号表示经单因素方差分析和Tukey检验差异极显著（***P<0.001）。
SlGRF1通过赤霉素信号通路激活芽系统形态建成基因
为阐明SlGRF1如何调控切割出芽，我们检测了其形成经典GRF‑GIF复合物的能力，该复合物已知可提高转化效率。酵母双杂交（Y2H）和双分子荧光互补（BiFC）实验证实SlGRF4与SlGIF1存在相互作用，但未检测到SlGRF1与SlGIF1的相互作用。通过酵母β‑半乳糖苷酶活性评估SlGRF1、SlGRF4和SlGIF1的转录激活活性，结果显示SlGRF1的转录激活能力约为SlGRF4的3倍（图6A）。这些结果表明，与SlGRF4不同，SlGRF1无需结合SlGIF1即可介导转录调控。我们对切割后8天的样品进行了差异表达基因（DEGs）转录组分析。将相对于处理前表达水平上调和下调的基因分别定义为AC上调DEGs和AC下调DEGs。值得注意的是，AC上调DEGs可能编码切割出芽过程的正向调控因子。比较分析显示，GA1处理后（相对于Pac处理）下调的DEGs（包括SlGRF1）中有67.5%属于AC上调DEGs，而仅有5.7%属于AC下调DEGs。该结果进一步证实GA1对芽再生过程具有负调控作用。我们将在grf1‑cr1和grf1‑cr2突变体中均下调的基因（相对于野生型对照）定义为grf1‑cr下调DEGs。比较分析显示，因SlGRF1突变而下调的基因中有62.5%属于AC上调DEGs，仅有7.6%属于AC下调DEGs。结果表明，赤霉素信号与转录因子SlGRF1共同调控一组创伤诱导基因，这些基因在切割出芽过程中主要呈上调趋势，且会被GA1处理或SlGRF1突变所抑制。为进一步阐明SlGRF1介导的赤霉素信号通路调控切割出芽的分子机制，我们分析了GA1对比Pac下调DEGs、grf1‑cr下调DEGs和AC上调DEGs三者共有的219个基因（图6B）。GO富集分析显示，这些共调控的潜在再生相关因子显著富集于芽系统形态发生通路（图6B）。
图6.SlGRF1在创伤信号中的功能鉴定。（A）酵母实验中SlGRF1、SlGRF4和SlGIF1的转录激活活性。采用ONPG法测定转化子的β‑半乳糖苷酶活性。数据来自3次独立实验，以平均值±标准差表示（n=9）。（B）切割响应基因的韦恩图，以及219个受SlGRF1调控且与赤霉素信号相关的重叠基因的GO富集分析。AC上调DEGs：创伤后8天（与0小时对照相比）表达上调的基因；grf1‑cr下调DEGs：创伤后8天SlGRF1突变体中（与野生型相比）表达下调的基因；GA1 vs Pac下调DEGs：创伤后8天AC植株中经GA1处理（与Pac相比）表达下调的基因。（C）利用pGRF1:gGRF1‑3×FLAG进行ChIP‑seq分析揭示的富集序列基序。（D）EMSA结果证实SlGRF1与特定DNA序列结合。基于ChIP‑seq数据鉴定出3个保守基序（W1–W3）。探针M1为W1的突变体，带有碱基替换突变（红色标注）。（E）SlGRF1对219个重叠基因的结合图谱。在219个重叠基因中，有59个基因在转录起始位点2kb范围内存在SlGRF1结合峰。（F）IGV可视化展示NAM1、EPF4、ER2和EF1α启动子区域中SlGRF1与AC（野生型）的ChIP‑seq峰。（G）受SlGRF1调控基因的表达谱。RNA‑seq分析显示野生型与grf1‑cr突变体植株间SlGRF1靶基因的转录水平存在差异。数据来自3次独立实验，以平均值±标准差表示（n=45）。星号表示经单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验差异极显著（***P<0.001）。
为鉴定SlGRF1的靶基因，我们利用pGRF1::GRF1::3xFLAG转基因株系，在创伤后8天进行了ChIP‑seq分析。对SlGRF1结合峰的基序富集分析显示，其高度偏好CACGTG顺式作用元件，该元件主要位于结合位点中心区域（图6C）。在富集基序中，我们选取3个候选序列进行凝胶迁移阻滞实验（EMSA），结果证实SlGRF1在体外可直接结合CACGTG基序（图6D）。随后，我们鉴定出1642个启动子区域含有SlGRF1结合位点的基因，其中59个属于上述219个候选基因（图6E）。值得注意的是，调控芽系统形态建成的关键基因NAM1、EPF4、ER2的启动子均能被SlGRF1结合，提示这些基因是SlGRF1的直接靶基因（图6F）。在grf1‑cr1和grf1‑cr2突变体中，这三个基因在创伤过程中的表达量相较于野生型植株均显著下调（图6G）。
在切割出芽过程中，SlGRF1蛋白丰度显著上升，并在诱导后12天达到峰值（图7A）。我们通过ChIP‑qPCR实验验证了SlGRF1在NAM1、EPF4、ER2启动子区域的富集程度，并以EF1α作为内参对照（图7B）。双荧光素酶报告实验显示，与GFP对照组相比，SlGRF1可使NAM1、EPF4、ER2的启动子活性提升6倍以上。在grf1‑cr1突变体背景下，利用组成型启动子EF1α驱动NAM1过表达，能够回补芽再生缺陷，使其表型恢复至野生型水平（图7C）。以上结果证实，SlGRF1‑NAM1转录模块是切割出芽过程的直接调控核心。我们进一步探究了SlGRF1对从头根再生及组织培养条件下芽再生的影响，发现SlGRF1既不影响从头根再生（图7D），也不影响芽分化培养基（SIM）上的芽再生效率。上述结果表明，SlGRF1特异性参与调控切割出芽过程，而不参与创伤后的从头根再生。
图7.SlGRF1介导切割出芽的分子与表型鉴定。（A、B）再生过程中SlGRF1蛋白动态变化（Western blot）。（A）Rubisco的丽春红染色作为上样量对照。EF1α用作阴性对照；（B）创伤后8天，野生型AC与pGRF1:gGRF1‑3×FLAG转基因植株中SlGRF1在体内与靶基因启动子的结合情况（ChIP‑qPCR）。数据来自3次独立实验，以平均值±标准差表示（n=60）。星号表示经非配对Student’s t检验差异极显著（***P<0.001）。（C）创伤后野生型AC、grf1‑cr1突变体及在grf1‑cr1背景下过表达NAM1株系的芽再生表型分析。（D）AC与grf1‑cr突变体外植体在无激素培养基上培养10天后的生根能力对比。（E）切割出芽过程模式图。在伤口愈合阶段，切口处内源反式玉米素核苷（tZR）含量上升，这对愈伤组织形成至关重要。创伤同时诱导赤霉素A1（GA1）合成，GA1与tZR协同促进愈伤组织形成。反之，GA1含量升高会通过抑制SlGRF1表达，促进愈伤组织膨大并抑制芽起始。激活的SlGRF1通过上调NAM1、EPF4和ER2的表达启动芽发生。此外，IAA、JA和SA参与调控叶原基的起始与发育，而ABA可能介导对新生茎尖分生组织（SAM）和芽的抑制作用。创伤在切割出芽的不同阶段改变多种植物激素的含量与功能。