英文题目：SPL13 controls tomato lateral branch outgrowth by regulating brassinosteroid biosynthesis and signal transduction
中文题目：SPL13通过调控油菜素内酯合成与信号转导调控番茄侧枝伸长
期刊名称：Horticulture Research
影响因子：8.7
作者单位：华中农业大学、赣南师范大学
DOI：https://doi.org/10.1093/hr/uhag007
研究人员以番茄为研究对象，解析了miR156a-SPL13模块调控番茄侧枝发育的分子机制，明确其通过油菜素内酯（BR）合成与信号通路发挥作用。研究发现，miR156a靶向抑制SlSPL13表达，SlSPL13作为核心转录因子，直接结合并激活侧枝抑制关键基因BRC1b，同时直接结合并抑制BR合成关键基因DWF；spl13突变体中BR含量显著升高，过表达BRC1b或敲除DWF回补spl13突变体侧枝过度伸长表型。该研究阐明了miR156a-SPL13-DWF/BRC1b通路调控番茄侧枝形态建成的分子机制，为番茄株型改良与产量提升提供了新靶点与新策略。
番茄株型直接决定果实产量，侧枝发育是株型建成的核心环节。miR156a-SPL13模块是调控植物生长发育的保守通路，前期研究证实其调控番茄侧枝数量，但具体分子机制尚不明确。BR作为关键植物激素，通过BR-BZR1-BRC1b通路调控侧枝伸长，DWF是BR合成关键基因，BRC1b是侧枝抑制核心基因。然而，SPL13与DWF、BRC1b的直接分子关联，以及miR156a-SPL13模块通过BR通路调控侧枝的机制仍未解析，限制了番茄株型定向改良育种。
实验选用番茄野生型Ailsa Craig（AC）及各类转基因、突变体材料，培养条件为25℃、16小时光照/8小时黑暗。取5周龄幼苗茎尖组织，用于基因表达分析、蛋白提取、激素定量与ChIP实验。外源处理采用农杆菌介导的烟草瞬时转化，用于双荧光素酶活性检测；检测技术涵盖RT-qPCR、Y1H、EMSA、ChIP-qPCR、双荧光素酶、LC-MS/MS等，每组设置3次生物学重复。
本研究首先检测了miR156a过表达（miR156a-OE）、SPL13过表达（SPL13-OE/flag）及CRISPR介导的SPL13基因敲除（CR-spl13）番茄株系的侧枝发育表型。结果显示，SPL13-OE/flag株系的侧枝生长受到抑制，而miR156a-OE与CR-spl13株系的侧枝生长显著增强（图1A）。5周龄幼苗中，miR156a-OE和CR-spl13株系的侧枝长度约为野生型（WT）的3倍（图1B）；SPL13-OE/flag株系的侧枝总长度仅为野生型的1/3左右（图1B）。综上结果表明，SPL13是调控番茄侧枝伸长的关键因子。
图1.过表达miR156a、过表达SPL13及SPL13敲除番茄植株的侧枝表型。（A）5周龄miR156a-OE、CR-spl13、SPL13-OE及野生型（WT/AC）植株代表性侧枝表型图。OE：过表达；CR：CRISPR/Cas9构建的基因敲除株系。标尺：1cm。（B）3个转基因株系与野生型植株的侧枝总长度平均值±标准误（±SE）。每个转基因株系设12次生物学重复，用于独立统计比较。采用t检验分析均值差异，**表示P<0.01，差异极显著。
已有研究证实，BRC1b和DWF是调控番茄侧枝伸长的关键基因。研究表明，DWF过表达株系（DWF-OE）与brc1b突变体的侧枝长度显著增加，而BRC1b过表达（BRC1b-OE）与dwf突变体的侧枝生长则受到显著抑制。本研究结果显示，CR-spl13植株的表型与brc1b突变体、DWF-OE植株相似，而SPL13-OE株系的表型与BRC1b-OE、dwf突变体植株相近（图1）。前期研究已证明，SPL13作为转录因子在细胞核中富集表达。基于上述结果，我们提出假说：SPL13可能通过上调BRC1b、下调DWF的表达来调控侧枝发育。与野生型相比，CR-spl13株系中BRC1b的表达量显著降低，而SPL13-OE株系中BRC1b表达量显著升高；DWF则呈现完全相反的表达模式（图2）。上述结果表明，miR156a-SPL13模块是调控BRC1b与DWF基因表达的核心因子。
图2.SPL13过表达株系与spl13敲除突变体茎尖中BRC1b和DWF的相对转录水平。5周龄幼苗茎尖提取总RNA，采用RT-qPCR分别对SPL13-flag过表达株系（SPL13-3、-6、-9）与CR-spl13突变体株系（-1、-10、-12）中BRC1b（A）和DWF（B）的相对转录水平进行定量分析。以野生型（WT）植株的BRC1b、DWF转录表达量设定为1.0，数据为3次重复的平均值±标准误（±SE）。**表示与野生型相比差异极显著（P<0.01；t检验）。SPLs家族转录因子通过结合基因启动子区域的GTAC顺式作用元件调控靶基因表达。本研究首先对BRC1b与DWF启动子序列进行分析，以验证SPL13与其的直接结合潜能。结果显示，BRC1b启动子含有8个GTAC元件，DWF启动子含有5个GTAC元件（图3A）。为验证GTAC元件的功能，本研究针对BRC1b启动子构建4个报告载体，分别为PBRC1b-1（-3095~-2801bp）、PBRC1b-2（-2624~-2333bp）、PBRC1b-3（-1581~-1266bp）和PBRC1b-4（-983~-240bp）（相对于翻译起始位点）。同时，针对DWF启动子构建3个报告载体，分别为PDWF-1（-2136~-1909bp）、PDWF-2（-1684~-1360bp）和PDWF-3（-1238~-366bp）（图3A）。利用酵母单杂交（Y1H）对上述启动子片段进行结合验证，结果表明，SPL13可结合BRC1b的4个启动子片段与DWF的3个启动子片段（图3B、C）。
图3.酵母单杂交实验验证SPL13与BRC1b、DWF启动子的结合。（A）长度为3095bp的BRC1b启动子与2136bp的DWF启动子结构示意图。BRC1b启动子含有8个GTAC顺式作用元件，DWF启动子含有5个。酵母单杂交实验中使用的载体包括：BRC1b的4个启动子片段载体（PBRC1b-1、PBRC1b-2、PBRC1b-3、PBRC1b-4）和DWF的3个启动子片段载体（PDWF-1、PDWF-2、PDWF-3）。各片段相对于翻译起始位点（TSS）的位置分别为：PBRC1b-1：−3095~−2801bp；PBRC1b-2：−2624~−2333bp；PBRC1b-3：−1581~−1266bp；PBRC1b-4：−983~−240bp；PDWF-1：−2136~−1909bp；PDWF-2：−1684~−1360bp；PDWF-3：−1238~−366bp。（B）SPL13与BRC1b、DWF启动子核心序列结合的酵母单杂交分析。将上述诱饵载体与SPL13猎物载体共同转化Y1H Gold酵母，以酵母对金担子素A（AbA）的抗性强弱，判断启动子片段（诱饵）与SPL13蛋白（猎物）的结合能力。分别将各诱饵载体与pGADT-Rec2-53、pGADT7共转化，作为阳性对照和阴性对照。为进一步验证SPL13与BRC1b、DWF启动子上GTAC元件的结合能力，研究利用SPL13-GST重组融合蛋白进行了EMSA实验。结果显示，仅SPL13蛋白可结合含核心GTAC顺式元件的DNA片段，对照GST蛋白无结合信号，该结果与酵母单杂交结论一致（图4A-C）。当核心结合元件GTAC发生突变后，SPL13与启动子DNA片段的结合作用完全消失。综合酵母单杂交与EMSA结果（图3、图4A-C），证明SPL13可直接结合BRC1b和DWF基因启动子的GTAC元件。
为验证SPL13对BRC1b、DWF的直接转录调控，研究在烟草叶片中瞬时共表达35S-SlSPL13与BRC1bPro-LUC或DWFPro-LUC载体，进行双荧光素酶（dual-LUC）实验（图4D）。以空载体pGreen II 62-SK（PG）为阴性对照，结果显示，共表达35S-SlSPL13可显著提高BRC1bPro-LUC的荧光素酶活性，却显著降低DWFPro-LUC的活性（图4E）。
同时，研究利用SPL13-Flag植株进行ChIP-qPCR实验以验证ChIP-seq结果。数据显示，含GTAC核心序列的2个BRC1b启动子片段（P2.5Kb、PTSS）和1个DWF启动子片段（DWF-PTSS）在SPL13-Flag免疫沉淀产物中显著富集；而不含GTAC序列的启动子片段（CK）无明显富集（图4F、G）。上述结果表明，SPL13通过结合BRC1b、DWF启动子的核心GTAC顺式元件调控其表达，进而影响番茄植株的生长发育。
图4.EMSA、双荧光素酶及ChIP-qPCR分析SPL13与BRC1b、DWF启动子的结合。（A-C）EMSA检测SPL13与BRC1b（A、B）及DWF（C）启动子的结合。探针为含GTAC核心基序的基因启动子片段；突变探针（mprobe）为核心元件GTAC替换为AAGA的相同片段，作为阴性对照；竞争探针为未标记的同源片段，以5倍摩尔过量（5×）加入。“−”“+”分别表示蛋白或探针的有无。红色箭头为DNA-蛋白复合物位置，黑色箭头为游离探针。双荧光素酶报告载体与SlSPL13效应载体示意图。报告基因分别由2513bp的BRC1b启动子和1565bp的DWF启动子驱动，SPL13由CaMV 35S启动子驱动。（E）SlSPL13对BRC1b、DWF启动子活性的影响。在本氏烟草中瞬时表达，以空载体PG为对照，其荧光值设为1.0，结果以相对倍数表示，设8次生物学重复。**表示t检验差异极显著（P<0.01）。（F、G）野生型与3个35S-SPL13-Flag株系（-3、-6、-9）的ChIP-qPCR 分析。上图为BRC1b（2513bp）和DWF（2500bp）启动子结构示意图；下图为qPCR定量富集结果，以野生型相对富集度为1，数据为3次重复的平均值±标准误（±SE）。**表示与野生型差异极显著（P<0.01；t检验）。敲除DWF或过表达BRC1b可回补spl13突变体的侧枝发育表型
为验证SPL13是否通过调控DWF和BRC1b来控制侧枝发育，本研究对SPL13与DWF、BRC1b的遗传关系进行了分析。在spl13突变体背景下，分别构建了DWF敲除（CR-dwf）和BRC1b过表达（OE/flag）株系。CR-dwf株系利用靶向DWF基因84bp区域的sgRNA进行编辑获得（图5A），不同CR-dwf株系中均检测到碱基缺失突变（图5A）。与spl1单突变体相比，dwf spl13双突变体的侧枝总长度显著降低（图5B-D），说明DWF能够介导SPL13对番茄侧枝分生组织伸长的调控效应。与spl13突变体相比，BRC1b-OE/flag株系2、5、6的BRC1b表达量显著升高，且BRC1b-OE/flag spl13植株的侧枝总长度显著减少（图6）。上述结果证实，DWF与BRC1b作为SPL13的下游因子，共同调控番茄侧枝伸长。
图5.spl13背景下CR-dwf株系的分枝表型。（A）dwf突变等位基因。在3个CRISPR/Cas9编辑的CR-dwf株系（-5、-6、-8）中，分别检测到DWF基因4bp、10bp和2bp的缺失突变，序列比对以野生型DWF为参照。sgRNA靶标序列以红色标注，PAM序列以黑色方框标出。（B、C）spl13单突变体与dwf spl13双突变体的侧枝表型分析。测定35日龄植株的侧枝总长度，数据为平均值±标准误（±SE），每个转基因株系设12次生物学重复。**表示与spl13相比差异极显著（P<0.01；t检验）。（D）转基因株系、spl13突变体及野生型植株中SPL13基因的PCR扩增产物。
图6.spl13突变体背景下BRC1b-OE/flag株系的分枝表型。（A）spl13突变体与spl13背景下BRC1b-OE株系的侧枝表型。（B）转基因株系、spl13突变体及野生型植株中SPL13基因的PCR扩增产物。（C）5周龄BRC1b-OE spl13幼苗茎尖中BRC1b的相对表达水平。qRT-PCR数据以spl13突变体中的表达量为1进行归一化，数据为3次生物学重复的平均值±标准误（±SE）。**表示与spl13相比差异极显著（P<0.01；t检验）。（D）spl13与BRC1b-OE spl13株系的侧枝表型分析。测定35日龄植株的侧枝总长度，数据来自3个转基因株系与spl13突变体，平均值±标准误（±SE），每个株系设12次生物学重复用于统计分析。**表示与spl13相比差异极显著（P<0.01；t检验）。
为探究SPL13是否通过BR合成影响番茄侧枝伸长，本研究对DWF-OE、spl13突变体及野生型植株中BR衍生物的含量进行定量检测，包括油菜素内酯（BL）、油菜素甾醇（TY）、栗精甾烷（CS）和6-脱氧栗精甾烷（6-DCS）（检测指标由本司完成）。其中，BL是活性最高的BR，CS为其直接合成前体，TY和6-DCS为CS的前体（图7A）。结果显示，与野生型相比，DWF-OE与spl13植株的BL含量均显著升高，TY和6-DCS含量显著降低（图7B）；CS含量在spl13突变体中降低，而在DWF-OE中升高（图7B）。综上结果表明，SPL13通过负调控BR合成影响番茄侧枝伸长。
图7.SPL13调控油菜素内酯的合成与信号转导。（A）BR合成通路中间产物的化学结构。红色箭头表示spl13植株中BR中间产物含量变化，橙色箭头表示DWF-OE植株中含量变化。（B）BL、CS、6-DCS和TY的含量。数据为3次生物学重复的平均值±标准误（±SE）。*表示P<0.05，**表示P<0.01，t检验。（C）miR156a-SPL13模块调控番茄侧枝伸长的模式图。miR156a负调控SPL13转录；SPL13通过促进BRC1b表达抑制侧芽伸长，同时抑制DWF表达，进而通过调控BR合成与信号通路影响侧枝伸长。BZR1：油菜素唑抗性因子1。
本研究首次揭示miR156a-SPL13-DWF/BRC1b是番茄侧枝伸长的核心调控通路，明确SPL13通过直接双向调控BR合成基因DWF与侧枝抑制基因BRC1b，同时影响BR合成与信号转导，实现对株型的精准控制。该研究填补了miRNA-转录因子模块通过油菜素内酯调控番茄株型的机制空白，为番茄株型改良、提升产量提供了关键分子靶点。应用层面，可通过编辑miR156a、过表达 SPL13/BRC1b、敲除DWF等策略，定向调控番茄侧枝生长，优化株型；同时，该保守通路可为马铃薯、辣椒等茄科作物，及大豆、棉花等经济作物的株型改良提供理论参考，推动作物株型定向育种技术发展。
Long Cui, Fangyan Zheng, Lesong Jia, Feng Hu, Guo Ai, Jie Ye, Taotao Wang, Zhengming Wang, Zonglie Hong, Robert M Larkin, Zhibiao Ye, Junhong Zhang, SPL13 controls tomato lateral branch outgrowth by regulating brassinosteroid biosynthesis and signal transduction,Horticulture Research, Volume 13, Issue 4, April 2026, uhag007, https://doi.org/10.1093/hr/uhag007