以Ggt1 基因敲除雄性小鼠为模型，探究Ggt1 缺失→肠道菌群失调→菌群代谢物紊乱→睾丸精子发生障碍的分子机制，阐明肠道菌群 — 代谢物 — 睾丸调控轴在男性不育中的作用。

图1 Ggt1敲除雄性小鼠表现出精子发生障碍和不育。A 统计分析幼鼠数量。Ggt1+/+、Ggt1+/−和Ggt1−/−雄性小鼠与正常雌性交配，记录三窝幼鼠的数量（n = 3）。B–D Ggt1+/+和Ggt1−/−雄性小鼠的精子浓度（B）、精子运动能力（C）以及异常精子比例（D）（n = 6）。E Giemsa染色显示Ggt1+/+和Ggt1−/−小鼠的精子。黑色箭头标示异常精子。比例尺=10 μm。F H&E染色显示Ggt1+/+和Ggt1−/−小鼠睾丸切片。比例尺 = 100 μm。G 免疫荧光染色检测LIN28（精原细胞标记）、SOX9（支持细胞标记）和SYCP3（精子细胞标记），以及免疫组化染色检测CYP11A1（莱迪氏细胞标记）在睾丸组织中的分布。星号标示精囊管异常间质间隙。比例尺 = 25 μm、25 μm、25 μm、200 μm。H 统计分析精原细胞、支持细胞、精子细胞和莱迪氏细胞数量与精囊管直径之比。阳性细胞数量在5只小鼠的100个精囊管中进行定量。在Ggt1+/+和Ggt1−/−小鼠睾丸中总睾酮水平的ELISA分析（n = 6）。Ggt1+/+和Ggt1−/−小鼠血清中总睾酮（J）、抑制素B（K）、FSH（L）和LH（M）水平的J–M ELISA分析（n = 6）。N、O为Ggt1+/+和Ggt1−/−小鼠睾丸组织中CYP17A1、CYP11A1和HSD3B1的Western blot（N）及定量分析（O），ACTB为对照。数据以均值±标准误表示。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；ns无显著性差异

首先构建全身性Ggt1敲除小鼠模型

在确保前期全身性Ggt1敲除小鼠模型构建成功的情况下，首先进行生育能力评估实验，纯合子敲除（Ggt1⁻/⁻）组的幼仔数量显著减少（图1A）。此外，Ggt1⁻/⁻小鼠附睾尾部精子浓度和精子活力降低（图1B, C），异常精子率升高（图1D），观察到的主要畸形为尾部卷曲和异常折叠（图1E）。此外，8周龄小鼠睾丸组织的H&E染色显示Ggt1⁻/⁻小鼠曲细精管结构松弛，曲细精管内生殖细胞减少（图1F）。在睾丸组织切片中对LIN28、SOX9、SYCP3和CYP11A1进行免疫荧光或免疫组化染色，分别用于表征不同的睾丸细胞类型，包括精原细胞、睾丸支持细胞、精母细胞和间质细胞。结果显示，与Ggt1⁺/⁺睾丸相比，Ggt1⁻/⁻睾丸中精原细胞和支持细胞数量增加，而精母细胞和间质细胞数量显著减少（图1G, H）。与Ggt1⁺/⁺组相比，Ggt1⁻/⁻组睾丸和血清中总睾酮水平以及血清中抑制素B水平显著降低（图1I–K）。然而，血清中卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）水平未观察到显著变化（图1L, M）。此外，Western blot分析显示，与Ggt1⁺/⁺睾丸相比，Ggt1⁻/⁻睾丸中睾酮合成相关蛋白（包括CYP17A1、CYP11A1和HSD3B1）表达显著降低（图1N, O）。通过对睾丸组织公开scRNA-seq数据的再分析，Ggt1在所有睾丸细胞谱系中均检测不到表达（图S3E, F）。这些发现表明Ggt1的缺失对精子发生有不利影响，而Ggt1⁻/⁻小鼠睾丸中观察到的生精障碍可能并非归因于Ggt1基因的直接遗传调控网络。相反，Ggt1缺失小鼠的雄性不育和生精障碍可能受到某些非遗传机制的影响。

图2 通过代谢组学分析，苯乙酰甘氨酸（PAGly）在Ggt1基因缺失小鼠的血清和睾丸中显著升高。A 基于Ggt1+/+与Ggt1−/−小鼠血清样本代谢谱的无监督主成分分析（PCA）。B 基于Ggt1+/+与Ggt1−/−小鼠睾丸组织代谢谱的PCA。C Ggt1+/+与Ggt1−/−小鼠血清代谢物的火山图（Ggt1−/− vs. Ggt1+/+，n = 6）。D Ggt1+/+与Ggt1−/−小鼠睾丸代谢物的火山图（Ggt1−/− vs. Ggt1+/+，n = 6）。E 显示血清样本（Ggt1−/− vs. Ggt1+/+）与睾丸样本（Ggt1−/− vs. Ggt1+/+）中差异代谢物重叠部分的Venn图。F 血清和睾丸样本中4种重叠代谢物水平的热图。G、H Ggt1+/+与Ggt1−/−小鼠血清和睾丸组织中苯乙酰甘氨酸（PAGly）的含量（n = 6）。I、J 对Ggt1+/+与Ggt1−/−小鼠睾丸中的PAGly水平进行斯皮尔曼相关性分析，分别与睾丸总睾酮水平（I）和精子浓度（J）。各组间显著调控的代谢物依据VIP ≥ 1且p值 < 0.05确定。投影中的变量重要性（VIP）通过OPLS-DA模型获得，p值由学生t检验得出。数据以均值±标准误表示。***p < 0.001

有文献表明GGT1参与GSH的细胞外分解代谢，在维持细胞内GSH浓度和氧化还原平衡中发挥关键作用，血清GGT1异常水平与代谢综合征的发病机制有关【1，2】。分别对Ggt1⁺/⁺和Ggt1⁻/⁻小鼠的血清和睾丸进行非靶向代谢组分析。值得注意的是，与Ggt1⁺/⁺小鼠相比，Ggt1⁻/⁻小鼠血清和睾丸中苯乙酰甘氨酸（PAGly）水平均升高（图2G, H），此外，Spearman相关分析显示睾丸PAGly水平与性腺内睾酮水平和精子浓度呈显著负相关（图2I, J）。这些发现表明PAGly水平升高可能与Ggt1⁻/⁻小鼠精子发生受损有关。

图3 PAGly处理抑制雄性小鼠的精子生成。A 采用质谱法对Ggt1+/+、Ggt1−/−以及PAGly处理过的Ggt1+/+小鼠（0 mg/kg和150 mg/kg）睾丸中PAGly浓度进行定量分析（n = 3）。B、C 经PAGly处理的小鼠精子浓度（B）及异常精子率（C）（n = 6）。D、E 对经PAGly处理的小鼠血清中总睾酮（D）和抑制素B（E）水平进行ELISA分析（n = 6）。F PAGly处理小鼠睾丸切片的H&E染色。比例尺=100 μm。G 睾丸组织中LIN28（生精细胞标志物）、SOX9（支持细胞标志物）和SYCP3（精子细胞标志物）的免疫荧光染色，以及CYP11A1（间质细胞标志物）的免疫组化染色。星号标示精囊管异常间质间隙。比例尺分别为25 μm、25 μm、250 μm、50 μm。H对精原细胞、间质细胞、精子细胞和间质细胞数量与精索管直径之比进行统计分析。从5只小鼠的100个精索管中定量测定阳性细胞数量。I为I型和J型Western blot（I）及定量分析（J），用于检测PAGly处理后雄性小鼠睾丸组织中CYP17A1、CYP11A1和HSD3B1的表达水平（n = 6）。小鼠分别以腹腔注射方式给予不同浓度的PAGly溶液，分别为0 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg和150 mg/kg。数据以平均值±标准误表示。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；ns无显著差异

关键代谢物 PAGly（苯乙酰甘氨酸）升高是生精损伤的核心诱因

为探索PAGly是否损害精子发生，向7周龄Ggt1⁺/⁺雄性小鼠腹腔注射不同浓度的PAGly（0、50、100、150 mg/kg），连续10天。质谱分析显示PAGly处理小鼠睾丸PAGly水平较对照组显著增加，且PAGly浓度的生理量级与Ggt1⁻/⁻小鼠处于同一数量级（图3A），评估了PAGly对精子发生的有害影响，结果显示与对照组相比，PAGly处理小鼠精子浓度降低（图3B），异常精子率升高（图3C）。此外，PAGly处理小鼠血清总睾酮和抑制素B水平低于对照组（图3D, E）。H&E染色分析显示PAGly处理诱导了曲细精管明显的结构破坏（图3F; 图S4）。睾丸组织免疫荧光和免疫组化染色显示，与对照组相比，高浓度PAGly处理（100、150 mg/kg）减少了睾丸中精母细胞和间质细胞数量（图3G, H）。Western blot分析显示，与对照组相比，PAGly处理小鼠睾丸中睾酮合成相关蛋白（包括CYP17A1、CYP11A1和HSD3B1）表达显著降低（图3I, J）。

图4 对Ggt1+/+和Ggt1−/−雄性小鼠粪便样本进行宏基因组测序分析。A Shannon、Simpson和Chao指数反映的α多样性（n = 6）。B Ggt1+/+与Ggt1−/−组之间的主坐标分析（PCoA）。采用ANOSIM检验组间显著差异（n = 6）。C 模块结构可视化。每个节点代表一个物种，不同颜色表示不同的模块。共现网络使用Gephi软件进行可视化。D 通过LEfSe分析确定的线性判别分析（LDA）得分，显示各组中的特征物种。E Ggt1+/+和Ggt1−/−组粪便宏基因组序列中PPDC和PPFOR基因的丰度。F Ggt1+/+与Ggt1−/−组之间含有PPDC和PPFOR基因的粪便微生物丰度的Wilcoxon秩和检验。数据以均值±标准误表示。*p < 0.05；**p < 0.01；ns 表示无显著差异

膳食苯丙氨酸（PHE）被肠道微生物群代谢为苯乙酸（PAA），随后由宿主肝酶催化与甘氨酸结合形成PAGly【3,4,5】。值得注意的是，Ggt1⁻/⁻小鼠表现出肠道屏障完整性受损和炎症标志物增加（图S7A–L），意味着与Ggt1⁺/⁺小鼠相比存在不同的肠道微生物群落和代谢特征。对Ggt1⁺/⁺和Ggt1⁻/⁻小鼠粪便进行了非靶代谢分析显示与Ggt1⁺/⁺组相比，Ggt1⁻/⁻组PHE水平降低（图S8C），PAA水平升高（图S8D）。此外，对Ggt1⁺/⁺和Ggt1⁻/⁻小鼠粪便样本进行宏基因组测序，评估微生物群落变化并深入探究肠道微生物群里与苯丙氨酸代谢之间的相互作用，LDA结果显示，Helicobacter apodemus、Mucispirillum schaedleri、Desulfovibrio sp.等在Ggt1⁺/⁺小鼠中富集，而Rikenellaceae bacterium、Bacteroidaceae bacterium、Prevotella sp. MGM1等在Ggt1⁻/⁻小鼠中富集（图4D）。有研究表明PHE被细菌PPDC和PPFOR催化转化为PAA【6】。随后，评估了粪便宏基因组序列中PPDC和PPFOR基因的丰度。结果表明，与Ggt1⁺/⁺组相比，Ggt1⁻/⁻组PPDC基因丰度显著增加，PPFOR基因丰度略有升高（图4E），并且Ggt1⁻/⁻组表达PPDC和PPFOR酶的细菌丰度显著高于Ggt1⁺/⁺组（图4F）。这些结果表明，PAGly水平升高归因于肠道微生物群失调引发的PAA产生增加。

图5 从Ggt1−/−小鼠移植的粪便微生物群损伤受体小鼠的精子生成。A 粪便微生物群移植（FMT）实验流程。Ggt1+/+ FMT表示接收来自Ggt1+/+小鼠微生物群的伪无菌小鼠，Ggt1−/− FMT表示接收来自Ggt1−/−小鼠微生物群的伪无菌小鼠。B 利用质谱仪对睾丸中PAGly浓度进行定量分析（n = 3）。C、D Ggt1+/+ FMT和Ggt1−/−-FMT雄性小鼠的精子浓度（C）及异常精子率（D）（n = 7）。E Ggt1+/+ FMT和Ggt1−/−-FMT小鼠睾丸切片的H&E染色。星号标示异常精囊管。比例bar = 100 μm。对睾丸组织进行LIN28（精原细胞标记）、SOX9（间皮细胞标记）和SYCP3（精子细胞标记）的免疫荧光染色，以及CYP11A1（莱迪细胞标记）的免疫组化染色。星号表示精囊管异常的间质空隙。比例尺为25 μm、25 μm、25 μm、100 μm。G 对精原细胞、间皮细胞、精子细胞和莱迪细胞数量与精囊管直径之比进行统计分析。在5只小鼠中，每100个精囊管内阳性细胞的数量进行了定量。H、I Ggt1+/+-FMT和Ggt1−/−-FMT雄性小鼠血清中总睾酮（H）和抑制素B（I）水平的ELISA分析（n = 6）。J、K Ggt1+/+-FMT和Ggt1−/−-FMT雄性小鼠睾丸组织中CYP17A1、CYP11A1和HSD3B1的Western blot（J）及定量分析（K）（n = 6）。数据以平均值±标准误表示。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；ns无显著性差异

肠道菌群失调是 PAGly 异常升高的根源，Ggt1 缺失破坏肠道屏障完整性、诱发肠道炎症

为验证Ggt1⁻/⁻小鼠中失调的肠道微生物群是否升高PAGly水平并可能损害精子发生，进行了粪便微生物群移植（FMT）实验。制备Ggt1⁺/⁺和Ggt1⁻/⁻小鼠的粪便悬液，分别移植到无菌小鼠中，每2天一次，持续8周（图5A）。在FMT方案结束时，从Ggt1⁻/⁻-FMT小鼠（接受Ggt1⁻/⁻小鼠肠道微生物群移植的受体小鼠）和Ggt1⁺/⁺-FMT小鼠（接受Ggt1⁺/⁺小鼠肠道微生物群移植的受体小鼠）收集血清，进行非靶向LC/MS以评估代谢物变化。质谱分析也证实Ggt1⁻/⁻-FMT小鼠睾丸内PAGly水平显著增加（图5B）。此外，与Ggt1⁺/⁺-FMT小鼠相比，Ggt1⁻/⁻-FMT小鼠出现肠道屏障损伤和炎症加剧（图S10A–J）。为评估来自Ggt1⁻/⁻小鼠的肠道微生物群对精子发生的有害影响，对精子浓度和异常精子率进行了定量。与Ggt1⁺/⁺-FMT小鼠相比，Ggt1⁻/⁻-FMT小鼠精子浓度更低，异常精子率更高（图5C, D）。此外，与Ggt1⁺/⁺-FMT小鼠相比，Ggt1⁻/⁻-FMT小鼠曲细精管内细胞数量更少，结构紊乱（图5E）。睾丸切片免疫荧光和免疫组化染色显示，Ggt1⁻/⁻-FMT小鼠中SYCP3标记的精母细胞和CYP11A1标记的间质细胞数量减少（图5F, G）。此外，Ggt1⁻/⁻-FMT小鼠血清总睾酮和抑制素B水平低于Ggt1⁺/⁺-FMT小鼠（图5H, I）。而且，与Ggt1⁺/⁺-FMT小鼠相比，Ggt1⁻/⁻-FMT小鼠睾丸中睾酮合成相关蛋白（如CYP17A1、CYP11A1和HSD3B1）显著降低（图5J, K）。总之，这些结果证明Ggt1⁻/⁻小鼠中失调的肠道微生物群导致高PAGly浓度和精子发生障碍。

图6 Ggt1+/+和Ggt1−/−小鼠睾丸的转录组分析。A Ggt1−/−与Ggt1+/+小鼠睾丸转录组分析的火山图（n = 3）。通过绝对log2倍数变化（FC）>1且p校正<0.05确定各组间差异表达基因（DEGs）。B RNA测序数据中精子发生特异性基因集合的GSEA分析（Ggt1−/− vs. Ggt1+/+）。C Venn图显示Ggt1−/−/Ggt1+/+与Ggt1−/−-FMT/Ggt1+/+-FMT之间睾丸转录组数据中的重叠DEGs。D Ggt1+/+和Ggt1−/−小鼠睾丸中mRNA表达水平与睾丸苯乙酰甘氨酸及血清总睾酮水平的斯皮尔曼相关性分析。红色表示正相关，蓝色表示负相关。显著性阈值设定为|r²| > 0.75且p值 < 0.05。E、F Ggt1+/+和Ggt1−/−小鼠睾丸组织中KLK1B27和KLK1B22的Western blot（E）和定量（F）分析（n = 6）。A、B Ggt1+/+和Ggt1−/−小鼠睾丸组织中KLK1B27和KLK1B22的免疫组化染色。免疫组化测定的平均光学密度使用Image-Pro Plus软件进行量化。比例尺 = 50 μm。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。*p < 0.05；**p < 0.01

分子通路机制：PAGly 通过 β2AR-STAT3-SOCS3-STAT5B-Klk1bs 轴抑制生精

为进一步阐明PAGly影响精子发生的分子机制，对Ggt1⁺/⁺、Ggt1⁻/⁻、Ggt1⁺/⁺-FMT和Ggt1⁻/⁻-FMT小鼠的睾丸组织进行了bulk RNA测序（RNA-seq）。 GSEA显示精子生成过程相关基因集呈负富集（表S4），如"类固醇激素代谢"、"类固醇代谢"、"精子获能"和"精子活力"（图6B）。此外，GSEA分析强调Ggt1⁻/⁻-FMT小鼠中类固醇代谢和精子获能过程相关基因集呈负富集（图S11C）。Spearman相关分析显示若干DEGs（如Klk1b21、Klk1b22、Klk1b24和Klk1b27）的表达与睾丸睾酮水平呈显著正相关（r²>0.75且p值<0.05），与睾丸PAGly水平呈显著负相关（r²<-0.75且p值<0.05）（图6D; 图S11D）。据报道，激肽释放酶家族（Klk1bs）成员（包括Klk1b21、Klk1b24和Klk1b27）在精子发生和男性生育力中发挥关键作用，敲低Klk1bs显著减弱关键类固醇生成酶CYP11A1和HSD3B1的表达，同时睾酮水平降低【7，8】。Western blot分析表明，KLK1B27和KLK1B22蛋白表达水平在Ggt1⁻/⁻小鼠睾丸（与Ggt1⁺/⁺小鼠相比）（图6E, F）和Ggt1⁻/⁻-FMT小鼠睾丸（与Ggt1⁺/⁺-FMT小鼠相比）（图S11E, F）中显著降低。对睾丸组织进行了免疫组化染色显示Ggt1⁻/⁻组间质细胞内KLK1B27和KLK1B22的平均光密度（MOD）值显著低于Ggt1⁺/⁺组（图6G, H）。

图7 PAGly通过G蛋白偶联受体β2AR调节Klk1b的表达。分别用0 μM、200 μM和500 μM PAGly处理初级小鼠 Leydig 细胞后，qRT-PCR分析Klk1b21、Klk1b22、Klk1b24和Klk1b27 mRNA的表达（n = 4）。B、C 分别用0 μM、200 μM和500 μM PAGly处理初级小鼠Leydig细胞后，Western blot（B）及定量分析（C）KLK1B27和KLK1B22的表达情况，ACTB为对照组（n = 3）。D 点图显示不同睾丸细胞类型中Adrb1和Adrb2的表达水平。OMIX（OMIX1000）睾丸样本的scRNA-seq数据经Seurat R包重新分析。E qRT-PCR分析在分别用二甲基亚砜（DMSO）、200 μM PAGly和10 μM异丙托品盐酸盐（ISO）处理的初级小鼠Leydig细胞中Klk1b21、Klk1b22、Klk1b24和Klk1b27 mRNA的表达（ISO为β-肾上腺素受体激动剂，n = 4）。F、G 分别用DMSO、200 μM PAGly和10 μM ISO处理初级小鼠Leydig细胞后，Western blot（F）及定量分析（G）KLK1B27和KLK1B22的表达（n = 3）。H qRT-PCR分析Klk1b21、Klk1b22、分别用DMSO、200 μM PAGly、200 μM PAGly + 10 μM普萘洛尔和200 μM PAGly + 10 μM ICI118,551处理初级小鼠 Leydig 细胞时，Klk1b24 和 Klk1b27 mRNA 的表达情况。普萘洛尔为非选择性β受体阻滞剂，ICI118551 为选择性β2受体拮抗剂（n = 4）。I：Western blot（I）及定量分析（J），分别检测在 DMSO、200 μM PAGly、200 μM PAGly + 10 μM 普萘洛尔和 200 μM PAGly + 10 μM ICI118551 处理后的初级小鼠 Leydig 细胞中 KLK1B27 和 KLK1B22 的表达水平（n = 3）。数据以平均值 ± 标准误（SEM）表示。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；ns 无显著差异

为进一步研究PAGly对间质细胞Klk1bs表达水平的影响，我们成功分离了高纯度的原代小鼠间质细胞（图S13A–C），并用不同浓度PAGly处理。Klk1b21、Klk1b22、Klk1b24和Klk1b27的mRNA表达水平以及KLK1B27蛋白表达水平呈剂量依赖性降低（图7A–C）。与PAGly结构相似的苯乙酰谷氨酰胺（PAGln）通过G蛋白偶联受体（GPCRs）（包括α₂A、α₂B和β₂-肾上腺素能受体）介导细胞反应【8】。此外，通过再分析单细胞RNA-seq数据，编码β₁-和β₂-肾上腺素能受体的Adrb1和Adrb2在间质细胞中表达（图7D）。我们因此推测PAGly也可能通过激活肾上腺素能受体触发睾丸间质细胞Klk1bs表达改变。因此，用广泛报道的β-肾上腺素能受体激动剂盐酸异丙肾上腺素（ISO）处理原代间质细胞。与PAGly类似，ISO也降低了间质细胞Klk1bs的表达水平（图7E–G）。然后，将原代间质细胞与β-肾上腺素能受体药理学抑制剂（非选择性β阻断剂普萘洛尔或选择性β₂拮抗剂ICI118,551）以及PAGly共处理。普萘洛尔和ICI118,551均显著缓解了PAGly诱导的Klk1b表达降低（图7H–J）。综上所述，这些发现表明PAGly通过激活间质细胞上的β₂-肾上腺素能受体抑制Klk1bs表达。

图8 转录因子STAT5B调控睾丸间质细胞中Klk1bs的转录水平。A GPCR信号通路示意图。该图表由BioGDP.com创建，并参考自ProteinLounge.com。B 点图显示不同睾丸细胞类型中GPCR信号通路下游转录因子的表达情况。OMIX（OMIX1000）样本的睾丸scRNA-seq数据经Seurat R包重新分析。C 使用整合性基因组可视化工具（IGV）对Klk1b21、Klk1b22、Klk1b24和Klk1b27在TSS±3 kb范围内ATAC峰的可视化结果。D 利用HOMER识别的ATAC峰在TSS±3 kb范围内的从头基序富集分析。E qRT-PCR分析感染了表达shRNA-Stat5b（shStat5b）或随机shRNA（NC）的慢病毒的初级小鼠睾丸间质细胞中，Stat5b、Klk1b21、Klk1b22、Klk1b24和Klk1b27 mRNA的表达水平（n = 3）。F、G 感染了表达shRNA-Stat5b（shStat5b）或随机shRNA（NC）的慢病毒的初级小鼠睾丸间质细胞中，STAT5B、KLK1B27和KLK1B22蛋白的Western blot（F）及定量分析（G）（n = 3）。数据以平均值±标准误表示。*p < 0.05；p < 0.01 

GPCR广泛分布于大多数组织的细胞膜上，在将细胞外信号转导为细胞内信号、从而激活下游信号级联中发挥关键作用【8】。越来越多的证据表明，关键转录因子（包括CREB、STATs、NF-κB、c-Jun、c-Fos、NFAT、SRF和ELKs（图8A））介导GPCR信号级联中的下游基因表达程序[9]，这些转录因子中的大多数在间质细胞中表现出丰富或特异性表达（图8B）。

通过再分析原代间质细胞的公开ATAC-seq数据，我们鉴定了Klk1b21、Klk1b22、Klk1b24和Klk1b27 TSS ±3 kb内的染色质可及区域（图8C）。使用Homer进行motif富集分析显示，CREB家族成员（CREB1、CREB3、CREB5）、JUN家族（JUN、JUNB、JUND）、NFAT5、NF-κB-p50/p65以及多种STAT蛋白（STAT1、STAT2、STAT3、STAT5A、STAT5B）的转录因子结合位点显著富集（图8D）。为验证这些转录因子对Klk1bs表达的调控作用，通过短发夹RNA（shRNA）敲低每个转录因子，然后检测Klk1bs表达变化（图8E–G; 图S14）。值得注意的是，STAT5B敲低导致Klk1bs mRNA和蛋白水平显著降低（图8E–G）。此外，CUT&Tag分析进一步揭示Klk1bs TSS ±3 kb区域存在转录因子STAT5B结合位点（图S15）。这些结果表明PAGly介导的β₂AR激活可能使下游转录因子STAT5B介导Klk1bs的转录调控。