英文题目：Metabolomics and Transcriptomic Analysis Revealed the Response Mechanism of Maize to Saline-Alkali Stress
中文题目：基于代谢组与转录组学的玉米苏打盐碱胁迫响应机制研究
期刊名称：Plant Biotechnology Journal
影响因子：12.8
作者单位：吉林农业大学
DOI：https://doi.org/10.1111/pbi.70292
关淑艳、马义勇团队以玉米为研究对象，系统解析了盐碱胁迫下活性氧（ROS）清除与类黄酮代谢的调控机制，并揭示了关键基因ZmCHI6与转录因子ZmWRKY82的调控作用。研究发现，耐盐碱自交系22KN3894较敏感系H23146在盐碱胁迫下积累了更少的ROS和更多的总类黄酮，离子毒性（Na⁺/K⁺比值）更低，抗氧化酶活性更高。代谢组学与转录组学联合分析锁定类黄酮生物合成通路为关键差异通路，并鉴定出核心基因ZmCHI6及其上游转录因子ZmWRKY82。通过酵母单杂交、双荧光素酶报告实验和EMSA，证实ZmWRKY82直接结合ZmCHI6启动子中的W-box元件并激活其表达。转基因拟南芥和玉米瞬时沉默实验进一步验证了该调控模块的正向调控功能。该研究首次在玉米中完整揭示了“ZmWRKY82→ZmCHI6→类黄酮合成→ROS清除→耐盐碱”的分子调控级联通路，为耐盐碱玉米分子育种提供了关键基因靶点与优异种质资源（22KN3894）。
全球耕地盐碱化问题日趋严峻，苏打盐碱地因其高pH特性，可对植物造成渗透、离子、氧化及高pH等多重复合胁迫损伤。玉米作为重要的粮食作物，其苗期对盐碱胁迫尤为敏感。目前，相关研究多聚焦于中性盐胁迫，而对苏打盐碱胁迫下玉米的响应机制，尤其是WRKY转录因子调控黄酮代谢途径抵御胁迫的完整通路尚不明确，缺乏系统的分子证据链。为此，本研究以耐盐碱与盐碱敏感两份玉米极端自交系为材料，综合运用生理生化指标检测、广靶代谢组学和转录组学联合分析，并结合酵母单杂交、电泳迁移率变动分析（EMSA）、转基因功能验证等多层次分子生物学手段，系统解析玉米苗期响应苏打复合盐碱胁迫的分子调控网络与生理适应机制。研究成果旨在丰富玉米非生物胁迫耐受理论，并为耐盐碱玉米分子育种提供关键基因资源与理论支撑。
本研究选用耐盐碱自交系22KN3894和敏感自交系H23146玉米种子，经次氯酸钠消毒、催芽育苗后，以125mmol/L、NaHCO₃:Na₂CO₃=9:1的苏打盐碱液对三叶期幼苗进行胁迫处理，设置正常对照，分别在胁迫第6天、第12天采集根系样本；新鲜根系用于生理指标测定与活性氧染色，部分根系经液氮速冻后置于-80℃冰箱保存用于转录组与广靶代谢组测序，根尖样本用固定液固定用于显微结构观察。转录组和广靶代谢组检测分析及后续验证实验均设置3次生物学重复。
为模拟田间多样苏打盐碱土壤环境，本研究先设置碳酸氢钠：碳酸钠摩尔比9:1的混合盐碱浓度梯度处理，测定不同胁迫浓度对玉米幼苗各项生长指标的影响。随机选取9份玉米材料开展预实验，梯度胁迫后各性状均出现显著差异；为消除自交本身遗传背景干扰，采用耐盐碱系数（相对值）评价耐逆能力。结合叶片萎蔫程度与生长指标变化结果显示：125mmol/L混合盐碱液（112.5mM NaHCO₃+12.5mM Na₂CO₃，pH 9.1~9.2）胁迫12d后，各材料性状分化差距最大，是评估玉米苗期耐逆最可靠浓度。后续使用该浓度对80份玉米自交系开展苗期耐盐碱鉴定，并对所有测定性状进行皮尔逊相关性分析。除相对根体积与株高、根长呈负相关，根总长与株高负相关，根表面积与其余生理指标负相关外，其余性状均为正相关。根据叶片萎蔫程度与综合耐逆D值，将全部材料划分为5个耐逆等级：2份自交系综合D值高于0.7，属于高耐盐碱材料；20份自交系D值低于0.4，为盐碱敏感材料。
以筛选获得的耐盐碱自交系22KN3894（KN3894）和敏感自交系H23146（H146）为试验材料开展系统表型与生理生化解析（图1A），盐碱胁迫下敏感材料H146叶片失水萎蔫程度显著更高、须根数量大幅减少，细胞膜损伤标志性物质丙二醛（MDA）与叶片相对电导率显著上升（图1E、F），而KN3894维持更高SOD、POD、CAT抗氧化酶活性、叶片相对含水量与总黄酮积累量（图1B–D、G、L）；离子测定结果表明盐碱胁迫诱导两类材料根系Na⁺富集、K⁺与Ca²⁺流失，H146的Na⁺/K⁺失衡程度远高于KN3894（图1H–K），NBT、DAB活性氧原位染色结合O₂⁻、H₂O₂定量检测直观证实H146根系与叶片活性氧大量累积，氧化胁迫损伤更严重。
图1.盐碱胁迫对玉米自交系表型及生理生化指标的影响。（A）玉米自交系KN3894与H146在盐碱胁迫下的表型变化，比例尺=5cm；（B-D）抗氧化酶SOD、POD及CAT的活性；（E）丙二醛（MDA）含量；（F）相对电导率；（G）相对含水量；（H）Na⁺含量；（I）K⁺含量；（J）Ca²⁺含量；（K）Na⁺/K⁺比值；（L）总类黄酮含量。**表示同一材料中盐碱处理组（SA）与对照组（CK）之间差异显著（*p<0.05，**p<0.01）；ns表示无显著差异。CK，对照组；SA，盐碱胁迫处理组；H146，H23146；KN3894，22KN3894。借助扫描电镜与石蜡切片对根尖显微结构观察进一步佐证生理差异背后的组织基础（图2A、B），正常条件下两类材料根尖细胞排列规整、维管束完整，盐碱处理后H146根尖细胞严重皱缩塌陷、维管束结构崩解，养分与水分转运通路受损，KN3894根尖细胞完整性、维管束损伤程度均显著优于敏感材料，综合地上表型、膜损伤指标、抗氧化系统、离子稳态、ROS积累、根系显微结构六大维度证据完整阐明：耐盐碱玉米22KN3894依靠更强抗氧化体系、稳定离子平衡与根系结构维持能力抵御盐碱带来的渗透、离子与氧化多重胁迫，根系结构保护、黄酮类抗氧化物质富集是其核心生理耐受特征。
图2.盐碱胁迫对玉米自交系根系的影响。（A）采用扫描电子显微镜（SEM）观察盐碱胁迫下玉米自交系KN3894和H146根系横切面与纵切面的结构特征。主图为低倍镜（80×）下根系整体结构，右上角插图为高倍镜（2000×）下根系显微结构。（B）采用石蜡切片技术观察盐碱胁迫下玉米自交系KN3894和H146根系横切面与纵切面的细胞形态。主图为低倍镜（40×）下根横切面整体结构，右上角插图为高倍镜（400×）下根细胞精细形态。H146，H23146；KN3894，22KN3894。选取三叶期KN3894、H146，使用125mmol/L混合盐碱分别胁迫6d、12d后采集根系，采用UPLC-MS/MS开展广靶代谢组检测（图3）。共计鉴定并定量1951种代谢物，涵盖黄酮、脂质、酚酸、氨基酸衍生物、糖类、生物碱等多类初生及次生代谢物质（图3A）；PCA主成分分析与样本相关性分析结果表明，苏打盐碱胁迫可显著重塑玉米根系全局代谢谱，两类材料的代谢特征差异随胁迫时长延长持续扩大，且各组生物学重复样本一致性良好，保证了组学数据稳定性（图3B、C）；以VIP>1、|log₂FC|≥1为筛选阈值共得到1606个差异积累代谢物（DAMs），其中敏感材料H146整体代谢扰动幅度更大，而KN3894可特异性持续富集黄酮、脂质等关键次生代谢组分（图3D-F）；K-means时序聚类将差异代谢物划分为12个表达亚类（图3G），其中第11类酚酸、萜类、生物碱为两类材料共有通用胁迫应答代谢物，第5、7、9类黄酮及脂质类物质为KN3894特异性持续诱导的抗逆代谢组分；进一步开展代谢物WGCNA加权共表达网络分析共划分15个代谢模块，其中绿松石模块富集二氢槲皮素、芹菜素等核心黄酮单体，属于KN3894特异性抗逆模块，蓝色模块富集柚皮素、海藻糖等渗透调节物质，为两类材料共有胁迫响应模块，两大模块均与总黄酮含量、根系钠钙离子指标显著相关，由此证实黄酮类次生代谢通路是玉米长期抵御苏打盐碱胁迫的核心代谢防御通路。
图3.KN3894与H146在盐碱胁迫下代谢组变化的分析。（A）代谢物概览，饼图展示了所检测到的代谢物总数及其不同分类；（B）不同材料及不同盐碱胁迫处理时间点下全部代谢物的主成分分析，PC1和PC2分别代表第一和第二主成分；（C）样本间相关性分析，热图展示了不同样本间的代谢物相关性，颜色深浅表示相关性强弱（红色越深表示正相关性越高）；（D）盐碱胁迫后两个材料间差异表达代谢物（DEMs）的层级聚类热图，热图展示了差异代谢物的表达模式，颜色表示代谢物的相对丰度（黄色表示上调，蓝色表示下调）；（E）两个材料在盐碱处理前后上调和下调差异表达代谢物的统计，黄色柱表示上调代谢物数量，蓝色柱表示下调代谢物数量；（F）盐碱处理后两个材料代谢组的高阶韦恩图（upset图），展示了盐碱胁迫下两个材料差异代谢物的共有和特有数量；（G）KN3894和H146差异代谢物的K-means聚类分析，X轴表示盐碱胁迫处理时间点，Y轴表示各代谢物的标准化Z-score，彩色线条表示各代谢物的表达动态，黑色线条表示聚类的代表性表达趋势。H146，H23146；KN3894，22KN3894。
对盐碱胁迫处理6d、12d的耐盐碱玉米自交系KN3894与敏感玉米自交系H146根系为材料进行转录组测序，共获得133.78Gb有效测序数据，完成40373个玉米基因功能注释。主成分分析（PCA）结果表明，盐碱胁迫可显著重塑玉米根系全局转录谱，PC1可解释31.67%的转录组总变异，转录扰动程度随胁迫时长延长逐步加剧，基因表达聚类热图亦证实两类基因型整体转录应答模式存在显著差异（图4A、B）。以FDR<0.05、|log₂FC|≥1为阈值筛选差异表达基因（DEGs）：胁迫6d、12d时，敏感材料H146分别鉴定出4445个、8812个差异表达基因，耐逆材料KN3894则分别鉴定出2229个、7593个差异表达基因，表明敏感基因型转录稳态受盐碱胁迫干扰程度更强（图4C）。韦恩图分析显示两类材料共有差异表达基因1301个，H146特有差异表达基因1006个，KN3894特有差异表达基因565个（图4D）。KEGG通路富集分析表明，H146特有差异基因主要富集于淀粉与蔗糖代谢、基础苯丙烷生物合成通路，以损伤修复类被动应激响应为主；KN3894特有差异基因显著富集于黄酮生物合成通路，反映耐逆基因型通过主动调控黄酮合成通路完成盐碱胁迫适应性应答的转录调控特征（图4E-I）。
图4.KN3894与H146在盐碱胁迫下转录组变化。（A）盐碱处理前后两个材料全部基因转录本的主成分分析（PCA），PC1和PC2分别代表第一和第二主成分；（B）基因转录本聚类热图，展示了盐碱胁迫下两个材料的基因表达模式，颜色表示基因的相对表达水平（红色表示上调，蓝色表示下调）；（C）盐碱处理前后两个材料上调和下调差异表达基因（DEGs）的统计，粉色柱表示上调基因数量，蓝色柱表示下调基因数量；（D）不同样本间差异表达基因的韦恩图，展示了盐碱胁迫下两个材料共有和特有的差异表达基因数量；（E）KN3894在盐碱胁迫下共同差异基因的KEGG富集分析；（F）H146在盐碱胁迫下共同差异基因的KEGG富集分析；（G）KN3894特有的565个DEGs的KEGG富集散点分布；（H）H146特有的1006个DEGs的KEGG富集散点分布；（I）响应盐碱胁迫的295个DEGs对应的KEGG富集位点；（E-I）圆点大小表示基因数量，颜色表示富集显著性。H146，H23146；KN3894，22KN3894。
利用转录组数据构建WGCNA加权基因共表达网络，共划分16个基因模块（图5A）。模块-性状关联分析表明，耐盐碱自交系KN3894的关键耐逆差异基因主要富集于MEgreen绿色模块，敏感自交系H146的胁迫响应差异基因则集中于MEblue蓝色模块（图5B）；胁迫12d样本的两组学联合富集结果显示，黄酮生物合成通路富集程度最高（图6）。选取二氢槲皮素、荆芥素、三羟黄酮、芹菜素、柚皮素5种核心抗逆黄酮代谢物进行关联分析，结果显示MEgreen模块与上述黄酮代谢物均呈极显著相关，其中与二氢槲皮素相关性最强（图5C）。MEgreen模块中，查尔酮异构酶编码基因ZmCHI6为核心枢纽基因，同时包含ZmCHS、ZmFLS、ZmF3'H等黄酮合成关键结构基因（图5D）。表达热图结果证实32个黄酮合成基因在两种基因型中存在明显差异表达模式，ZmCHI6、ZmFLS、ZmF3'H等关键基因在KN3894中显著上调，表明KN3894通过持续激活黄酮合成通路积累黄酮类代谢物以抵御盐碱胁迫（图5E、F）。
图5.盐碱胁迫下转录组与代谢组的联合分析。（A）盐碱胁迫相关基因的加权基因共表达网络分析（WGCNA），展示了各模块中包含的差异表达基因数量；（B）模块与样本间的相关性，颜色表示相关性强弱（红色表示正相关，蓝色表示负相关）；（C）基因与五种代谢物（二氢槲皮素、荆芥素、三叶草素、芹菜素、柚皮素）的WGCNA分析，橙色线条表示极显著相关，线条越粗表示相关性越强；（D）MEgreen模块基因调控网络分析，中心圆圈为核心基因；（E）类黄酮生物合成途径中代谢物的热图，方块表示代谢物积累，黄色表示上调，紫色表示下调；CHS，查尔酮合酶；CHI，查尔酮异构酶；F3'H，类黄酮3'-羟化酶；F3H，黄烷酮3-羟化酶；FLS，黄酮醇合酶；FNSI，黄酮合酶；（F）类黄酮生物合成途径中结构酶基因表达热图，红色表示上调，蓝色表示下调；（G）类黄酮生物合成中结构基因与转录因子（TFs）的共表达网络，彩色线条表示转录因子（彩色填充方块）与类黄酮生物合成相关基因（绿色填充圆圈）之间的表达相关性，红色表示高相关，蓝色表示低相关，图中实心圆圈和方块的大小表示在网络中的连通度。H146，H23146；KN3894，22KN3894。
进一步从MEgreen模块筛选得到隶属于WRKY、MYB、NAC等10个家族的119个转录因子，通过皮尔逊相关系数构建共表达调控网络，筛选出连通度最高且与ZmCHI6高度相关的转录因子ZmWRKY82（图5G）。转录组FPKM数据显示，ZmWRKY82可被盐碱胁迫诱导表达，且KN3894中表达水平显著高于H146，提示ZmWRKY82是造成两类基因型耐逆差异的核心上游转录因子。
图6.转录组与代谢组共富集的KEGG通路。（A）和（B）分别为H23146在盐碱处理6天和12天时的富集通路；（C）和（D）分别为22KN3894在盐碱处理6天和12天时的富集通路。红色柱表示代谢物的富集，绿色柱表示基因的富集。
采用荧光定量qRT-PCR验证黄酮通路结构基因与ZmWRKY82表达趋势，定量结果与RNA-Seq FPKM表达模式完全一致，证明两类材料耐逆差异与ZmWRKY82及黄酮合成基因表达高度相关。
序列分析发现ZmCHI6启动子上游2000 bp存在两处W-box顺式结合元件（图7A）。酵母单杂交（Y1H）结果证明ZmWRKY82可结合ZmCHI6完整启动子片段（图7B）；烟草双荧光素酶瞬时试验证明ZmWRKY82可激活ZmCHI6启动子，产生强荧光信号（图7C、D）；EMSA凝胶迁移体外验证ZmWRKY82蛋白特异性结合含W-box的标记探针，突变探针无结合条带（图7E、F）。三重互作实验共同证实ZmWRKY82直接结合ZmCHI6启动子并正向激活其转录。
图7.盐碱胁迫下ZmWRKY82调控ZmCHI6的表达。（A）ZmCHI6启动子示意图（翻译起始位点上游2000 bp）及用于酵母单杂交（Y1H）实验的诱饵和猎物载体构建，红色方框表示W-box顺式作用元件，“P1”和“P2”为各含一个W-box核心序列的两个片段；（B）ZmWRKY82与ZmCHI6启动子的酵母单杂交实验；（C）以空载体为阴性对照的本氏烟草叶片双荧光素酶实验；（D）（C）图中LUC活性的定量分析；（E,F）电泳迁移率变动分析（EMSA）显示ZmWRKY82直接特异性结合ZmCHI6启动子中的W-box元件，箭头指示结合的蛋白-DNA复合物和游离探针，“+”或“−”表示左侧所示相应组分的存在或缺失，星号表示差异极显著（**p<0.01）。
不同胁迫时间梯度qRT-PCR显示，随盐碱胁迫时长增加，KN3894与H146中ZmWRKY82和ZmCHI6的转录水平同步上调，且二者在耐逆材料KN3894中的诱导表达幅度显著高于敏感材料H146，呈现协同表达模式（图8A、B）。酵母异源耐逆点板试验证实，过表达ZmWRKY82的酿酒酵母菌株耐盐碱性显著优于空载对照菌株，初步验证ZmWRKY82可提升细胞层面盐碱耐受性（图8E）。进化分析表明ZmWRKY82与拟南芥AtWRKY51为同源基因，据此构建ZmWRKY82过表达纯合T3代拟南芥株系OE-2、OE-18，并采用atwrky51两种T-DNA插入突变体开展功能验证；盐碱胁迫处理12d后表型观察显示过表达株系耐逆能力显著提升，而atwrky51突变体表现出明显盐碱敏感表型（图8C）。生理指标测定结果表明，过表达株系SOD、POD、CAT抗氧化酶活性显著升高，MDA、H₂O₂、O₂⁻等活性氧及膜损伤指标含量显著降低（图8D、J-O）；同时过表达株系黄酮总量及同源AtCHIL基因表达水平显著上调，突变体则呈相反变化趋势（图8H、I）。利用AsODN反义寡核苷酸对玉米内源ZmWRKY82进行瞬时沉默后，玉米根系ZmCHI6表达量与总黄酮积累量同步显著下降（图8F、G）。
图8.ZmWRKY82的功能鉴定。（A）H146在盐碱胁迫（125mM）下不同时间点ZmCHI6和ZmWRKY82基因的相对表达量；（B）KN3894在盐碱胁迫（125mM）下不同时间点ZmCHI6和ZmWRKY82基因的相对表达量；（C）转基因拟南芥中ZmWRKY82耐盐碱性的表型分析；（D）转基因拟南芥中ROS的测定；（E）ZmWRKY82在酵母中的耐盐碱性分析；（F,G）ZmWRKY82在玉米根系中的基因沉默，（F）基因沉默后ZmWRKY82和ZmCHI6的表达水平，（G）基因沉默后的类黄酮含量；sODN，正义寡核苷酸；AsODN，反义寡核苷酸，通过AsODN方法在玉米根系中沉默ZmWRKY82；（H-O）转基因拟南芥生理生化指标的检测，（H）AtCHIL的表达量，（I）类黄酮含量，（J）H₂O₂含量，（K）O₂⁻含量，（L）SOD活性，（M）POD活性，（N）CAT活性，（O）MDA含量。数据表示为三次生物学重复的平均值±标准差（n=3），星号表示差异极显著（**p<0.01），ns表示无显著差异。CK，对照组；SA，盐碱胁迫处理组。
上述多层次体内外功能验证共同证实，ZmWRKY82通过正向调控ZmCHI6促进黄酮类物质生物合成，增强植株活性氧清除能力、维持离子稳态并保护根系结构，从而正向调控玉米苗期苏打盐碱胁迫耐受性（图9）。
图9.极端材料在盐碱胁迫下响应机制的模式图。在盐碱胁迫下，22KN3894中ZmWRKY82的诱导表达水平高于H23146，上调表达的ZmWRKY82通过直接结合ZmCHI6启动子，促进类黄酮的积累并清除过量的ROS，从而提高植株对盐碱胁迫的耐受性。
本研究以耐盐碱玉米自交系KN3894与盐碱敏感自交系H146为试验材料开展生理、转录组及代谢组联合解析，证实黄酮合成通路是玉米抵御苏打复合盐碱胁迫的核心防御通路；经加权共表达网络筛选获得上游转录因子ZmWRKY82与通路枢纽结构基因ZmCHI6，酵母单杂交、双荧光素酶及EMSA试验明确ZmWRKY82可特异性识别ZmCHI6启动子W-box顺式元件并激活其转录，酵母异源表达、拟南芥转基因及玉米瞬时沉默体系多层次功能验证表明，ZmWRKY82通过转录激活ZmCHI6促进黄酮大量累积，增强植株ROS清除能力、维持离子稳态与根系结构完整性，正向调控玉米苗期苏打盐碱耐受性，本研究首次解析玉米ZmWRKY82-ZmCHI6黄酮调控模块的抗逆分子机制，为玉米耐盐碱分子育种提供理论支撑与核心基因靶点。首先建立标准化胁迫鉴定体系，筛选耐逆与敏感极端种质，测定表型、抗氧化指标及根系显微结构，明确生理差异机制；对梯度胁迫样本开展转录组与代谢组联合测序，通过WGCNA共表达网络挖掘核心抗逆模块、上游转录因子与关键结构基因；经酵母单杂、双荧光素酶、EMSA验证转录因子与靶基因的直接调控关系；再通过酵母异源表达、拟南芥转基因、作物瞬时沉默完成功能验证，最终构建完整抗逆调控模型，为分子育种提供依据。Chunlai Wang， Xiaotong Wei， Yimeng Wang， et al. Metabolomics and transcriptomic analysis revealed the response mechanism of maize to saline-alkali stress[J]. Plant Biotechnology Journal, 2025, 23(12): 5397-5416.