①HS-SPME-GC-MS分析
通过HS-SPME-GC-MS鉴定出100种VOCs。七个PDT样品共享18种VOCs，PDT0独有11种，PDT2和PDT4各独有2种，PDT8、PDT10、PDT15和PDT22各独有1种；不同发酵时期VOCs的比例和含量各不相同，醇类、酮类、醛类和烃类是主要挥发性物质。总VOC量从PDT0到PDT4显著增加，再从PDT4到PDT15呈波动下降，总量在PDT22时达到峰值；PLS-DA模型显示了不同发酵时间的明显分离。
醇类占VOCs比例最高（34.64%-48.18%），主要由芳樟醇、(E)-芳樟醇氧化物（呋喃型）和(Z)-芳樟醇氧化物（呋喃型）组成。这三种糖苷来源醇类在SSF中呈波动增加：发酵22天后芳樟醇和(Z)-芳樟醇氧化物（呋喃型）分别增加1.81倍和24.87倍；(E)-芳樟醇氧化物（呋喃型）在PDT0中未检测到，但22天后占风味化合物的17.74%。P. polonicum分泌的β-葡萄糖苷酶在整个SSF过程中表现出持续高活性，是糖苷来源醇类增加的主要原因。2-乙基-1-己醇由P. polonicum新产生（早期未检出），从PDT4到PDT22呈波动下降；α-松油醇在第4天达到最大值。
酮类在PDT0中占第二大比例（20.75%），醛类为第三大（15.24%），经22天发酵后分别下降82.57%和76.27%。α-紫罗酮和(E)-β-紫罗酮在发酵前4天含量较高；α-紫罗酮第4天时为PDT0的1.77倍，22天后下降40.98%，(E)-β-紫罗酮第四天后大幅下降。二氢-α-紫罗酮在早期未检出，发酵后期开始积累。己醛（0.76%-18.04%）含量在PDT4达到峰值（PDT0的82.30倍）后下降；苯甲醛（0.46%-5.95%）在PDT0中含量最高，22天后下降约60%。
发酵过程中新产生五种PDT0中未检出的甲氧基苯化合物（2-甲基苯甲醚、4-乙基苯甲醚、1,4-二甲氧基苯、1,3-二甲氧基-2-甲基苯和5-甲氧基-6,7-二甲基苯并呋喃），其中1,4-二甲氧基苯（0.30%-18.51%）呈增加波动趋势。P. polonicum可分泌单宁酶，从而在黑茶中生物合成甲氧基苯化合物。
根据VOCs热图的层次聚类分析，整个发酵过程可分为四个阶段：PDT0（组I）、早期0-4天（组II）、中期4-10天（组III）和晚期10-22天（组IV），据此选择PDT0、PDT4、PDT10和PDT22进行后续综合分析。
从100种VOCs中筛选出19种rOAV >1的关键香气化合物，包括(E)-β-大马士酮（335.00-1175.00）、(E)-β-紫罗酮（210.00-3682.86）、芳樟醇（393.27-1365.73）、2-异丙基-3-甲氧基吡嗪（3741.03-12,312.82）、2-甲氧基-3-仲丁基吡嗪（18,020.00-86,020.00）、3-异丁基-2-甲氧基吡嗪（2050.00-6596.77）等。早期(E)-β-紫罗酮、(E)-β-大马士酮和芳樟醇rOAV较高，是主要风味物质；到中期其rOAV分别下降89.70%、55.76%和35.48%。随着发酵进行，甲氧基吡嗪rOAV显著增加，风味从花香果香转向泥土、甜椒样和青豌豆样特征。2-甲基-3-异丁基吡嗪（检测阈值0.0062 μg/L）首次在黑茶中被鉴定出来。
图3. 采用GC–MS技术对不同发酵时间的波兰茶（PDT）中挥发性有机物（VOCs）进行分析的结果。(A)各类VOCs的物种数量；(B)VOCs的维恩图；(C)分类后VOCs的相对含量；(D)不同发酵时间下PDT中VOCs变化趋势；(E)VOCs谱图的PLS-DA得分图；(F)源自糖苷类和类胡萝卜素的VOCs可能代谢途径；(G)PDT中VOCs的热图及层次聚类分析（热图通过log2（相对丰度）值进行标准化）。
② HS-GC-IMS分析
在PDT样品中共发现167个峰，鉴定出95种VOCs，分为八组；部分VOCs以二聚体和单体形式共存。不同发酵阶段可被PLS-DA模型明显分离。P. polonicum发酵极大地影响了黑毛茶的香气。
酸类物质经22天发酵显著降解86.14%，主要是丁酸、丙酸、乙酸和2-甲基丙酸等刺激性气味的酸。醇类、酯类、杂环化合物和烃类（分别占19.93%-25.38%、5.49%-10.73%、3.70%-6.77%、0.14%-0.32%）在早中期持续上升但后期下降；醛类在早期显著增加后中后期显著下降。总体而言，醇类和酮类是PDT的主要VOCs，且未发现其他类别有显著波动趋势。
在气味活性分析中，共筛选出56种rOAV >1的关键VOC。2-异丁基-3-甲氧基吡嗪在每个发酵阶段rOAV均为最高，主导了整体风味特征。早期(Z)-4-庚烯醛影响显著（rOAV仅次于2-异丁基-3-甲氧基吡嗪），至中期其rOAV下降近79%，此后影响逐渐减弱。二甲基硫醚在中期rOAV增加2.36倍，二甲基三硫化物在早期上升7.40倍。异丁酸乙酯和2-甲基丁酸甲酯在早期分别增加3.20倍和44.93倍，贡献果香，其影响在中期至后期持续增长。GC-MS与GC-IMS共鉴定出69种rOAV >1的关键香气物质。
图4. 通过HS-GC-IMS检测到的不同发酵阶段PDT中挥发性有机物的分布特征。(A) 挥发性有机物指纹图谱。(B) 挥发性有机物分布特征的PLS-DA得分图。(C) 挥发性化合物类别数量。(D) 四个PDT样品中挥发性有机物的占比。(E) 不同PDT样品间主要挥发性有机物相对含量的比较。（数据表示平均含量，单位：μg/g）
③关键差异VOCs筛选及代谢途径
通过OPLS-DA两两比较（PDT0 vs PDT4、PDT4 vs PDT10、PDT10 vs PDT22，R²X和Q²均>0.9），结合rOAV >1、VIP >1标准，共筛选出64种关键差异VOCs。其中19种在三个发酵阶段均存在，对区分发酵阶段发挥关键作用。早期含量较高的差异VOCs包括乙偶姻、水杨酸甲酯、二甲基三硫化物和(Z)-3-己烯-1-醇等11种；中期1-辛烯-3-醇、异丁酸乙酯和丙酸乙酯浓度较大；后期2,4-己二烯醛、二甲基硫醚、(E)-2-壬烯醛、1-戊烯-3-酮和2-戊酮大量产生。这些关键差异VOCs可用于判断P. polonicum发酵黑茶的阶段。
P.polonicum发酵过程中关键差异VOCs的形成主要由三条途径驱动：①氨基酸降解——缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸分别是2-异丙基-3-甲氧基吡嗪、2-甲氧基-3-仲丁基吡嗪和3-异丁基-2-甲氧基吡嗪的前体；蛋氨酸降解产生二甲基硫醚和二甲基三硫化物等含硫化合物；②脂肪酸氧化降解——亚油酸氧化产生己醛、1-辛烯-3-醇、(E)-2-庚烯醛、(E)-2-辛烯醛和(E)-2-壬烯醛，亚麻酸降解产生(Z)-3-己烯-1-醇和(E)-2-己烯醛，涉及LOX、HPL和ADH等酶；③糖苷水解——芳樟醇来源于糖苷前体代谢，水杨酸甲酯由β-樱草糖苷或β-吡喃葡萄糖苷水解产生。这些转化很可能由P. polonicum分泌的胞外酶催化。
图 5. (A) 甲氧基吡嗪类化合物与 (B) 硫醚类化合物的可能合成路径；(C) 光动力疗法（PDT）中关键差异性脂肪酸衍生挥发性有机物的可能形成路径。
经波兰毕赤酵母（P.polonicum）发酵的黑茶感官特性变化
①茶汤颜色
茶汤颜色随发酵时间从黄色转变为棕色。色度参数显示，a*（红度）和C*（饱和度）在早期发酵阶段先增加、中后期下降；L*（亮度）和b*（黄度）在整个发酵过程中持续下降。茶色素方面，茶黄素（TFs）和茶红素（TRs）含量在早期阶段显著增加而后续下降，茶褐素（TBs）在早中期显著增加122.45%，后期略有下降。
②电子鼻
PDT的香气特征明显受到P. polonicum发酵时间的影响。随着发酵的延长，检测胺类、强氧化、刺激性气态有机化合物和可燃性气态化合物的传感器响应值逐渐降低，表明胺类、醇类等芳香物质减少。相反，响应烷烃和芳香族化合物的传感器呈现双向增加和随后下降的趋势，表明芳香族化合物和烷烃在发酵过程中积累到一定程度。这些结果表明P. polonicum发酵导致PDT中可燃气体、芳香族和刺激性挥发性物质水平降低。电子鼻数据的PCA分析揭示了PDT0和PDT4的重叠置信区间，表明它们的香气特征具有相似性；而PDT0和PDT22在PCA图上的显著空间分离突出了P. polonicum发酵对改变黑茶风味特征的重大影响。
③电子舌
不同发酵时长的PDT茶汤之间存在味觉传感器强度的变化，PCA有效地区分了四种茶，其中PDT10和PDT22特别相似。PDT缺乏酸味，四种茶汤在咸度上没有显著差异，但在其他味觉指标上差异明显。醇厚度在发酵过程中显著下降；甜度早期增加但后期显著下降；鲜味早中期增加、后期显著下降；涩味持续减少直到不再可感知；苦味呈波动趋势。本研究中，P. polonicum分泌的单宁酶、PPO和β-葡萄糖苷酶在黑茶发酵过程中水解了儿茶素（特别是没食子酰化儿茶素）和没食子酸，降低了电子舌显示的涩味。经过22天发酵，没食子酸、总儿茶素和总没食子酰化儿茶素的浓度分别为未发酵黑茶的5.79%、17.72%和5.78%。EGCG、GCG、ECG和CG的含量在发酵过程中也显著下降。这些变化可归因于儿茶素的显著减少。此外，咖啡因和茶碱在发酵过程中增加。发酵早期苦味加剧可能与非没食子酰化儿茶素（EGC、GC和EC）和苦味生物碱（如可可碱和咖啡因）的联合增加有关；与PDT4相比，PDT10的苦味降低主要归因于没食子酸和总没食子酰化及非没食子酰化儿茶素含量的大幅下降。这些生化变化显著影响了茶的苦味和涩味特征，增强了茶味的复杂性和平衡性，改善了整体品质和适口性。苦味和苦味后味以及涩味和涩味后味分别呈正相关。发酵过程中TBs含量的增加也有助于降低苦味。
图6.（A）深色茶经茶源P.polonicum发酵后冲泡所得茶汤的显微图像与（B）色差分析；（C）经茶源P.polonicum发酵的深色茶中茶黄素含量变化、（D）茶红素含量变化及（E）茶褐素含量变化；（F）雷达图与（G）PCA得分图，展示由电子鼻检测到的传感器响应值；（H）PCA得分图与（I）电子舌传感器的雷达图。
本研究从茯砖茶生产过程中分离鉴定出一株P.polonicum XL6–1菌株，结果表明该菌在固态发酵过程中显著改变了黑茶的风味特征和非挥发性代谢物谱。发酵导致儿茶素、游离氨基酸和可可碱含量降低，22天发酵后儿茶素总量和游离氨基酸总量分别下降82.28%和83.14%，苦味和涩味相应消除。P.polonicum分泌了大量胞外酶，对黑茶代谢物的形成至关重要。发酵期间，HS-SPME-GC-MS和HS-GC-IMS分别鉴定出100种和95种挥发性有机化合物，其中甲氧基吡嗪类和甲氧基苯类化合物显著增加，而酸类显著减少，从而提升了黑茶品质。关键香气化合物分析显示，茶的风味特征从发酵早期的花香和果香调（如芳樟醇、(E)-β-紫罗兰酮和(E)-β-大马士革酮）转变为后期的泥土、青椒和青豌豆调（如2-异丁基-3-甲氧基吡嗪、二甲基硫醚和二甲基三硫醚）。糖苷水解、氨基酸代谢和脂肪酸氧化被认为是P.polonicum固态发酵黑茶过程中差异香气化合物形成的主要代谢途径。该发现表明P.polonicum在茯砖茶发酵过程中对品质形成起着关键作用，未来研究将探索其作为发酵剂的目标化应用，以稳定和提升茯砖茶的风味与品质。